Změny ve fosforylaci vybraných proteinů ve spermiích během jejich maturace

Bc. Barbora Klusáčková

Master's thesis

Changes in the phosphorylation of selected proteins in sperm during their maturation

Abstract:

Aby spermie byla schopná oplodnit oocyt, musí projít procesem maturace. Během ní se u spermií odehrávají kvalitativní změny, které dají spermiím fertilizační schopnost. Maturace se odehrává již při průchodu spermií nadvarlaty (epididymální maturace), pokračuje během ejakulace a dále se odehrává i v samičím pohlavním traktu. Zde spermie prodělává kapacitaci. Kapacitace souvisí se změnami na plazmatické membráně, ale i uvnitř spermie. Tyto změny vedou k zahájení hyperaktivace motility, a nakonec k vylití akrozomálního váčku. Jelikož je spermie již transkripčně neaktivní, všechny změny na jejích proteinech se odehrávají prostřednictvím posttranslačních modifikací. Jednou z těchto posttranslačních úprav je fosforylace proteinů, která se může odehrávat na tyrozinových, serinových a treoninových zbytcích. Fosforylace je proces zodpovídající za mnohé buněčné procesy a je jedním z hlavních markerů kapacitace. Cílem této práce bylo vyhodnotit, zda se během jednotlivých maturačních stádií vyskytuje u kančí spermie fosforylace na tyrozinových a serinových zbytcích, a jak se případně tato fosforylace během maturace proměňuje. Vycházeli jsme z hypotézy, že se ve spermiích v různých maturačních stádiích budou vyskytovat změny v lokalizaci fosforylovaných proteinů a v míře fosforylace, jelikož fosforylace je provázána s procesem maturace. V této diplomové práci byla detekována fosforylace na tyrozinových a serinových zbytcích pomocí specifických protilátek. Fosforylaci jsme zkoumali pomocí imunodetekce a denzitometrie. Sledovali jsme změny mezi ejakulovanými a kapacitovanými spermiemi a spermiemi po akrozomální reakci. Pomocí denzitometrické analýzy jsme u tyrozinu pozorovali nárůst fosforylace během kapacitace a dále také po akrozomální reakci. Nalezli jsme 10 proteinů vykazujících tyrozinovou fosforylaci a u většiny z nich jsme pozorovali signifikantní nárůst relativní optické denzity během kapacitace. Dále jsme pomocí imunofluorescence pozorovali několik fluorescenčních vzorů vyskytujících se napříč všemi maturačními stádii. Byli jsme schopni určit vzor tyrozinové fosforylace na akrozomální oblasti, v EqSS a v bičíku jako vzor, který se začíná více vyskytovat během kapacitace. Fosforylace na tyrozinu v těchto oblastech by mohla tedy být markerem kapacitace. Na serinu jsme imunodetekovali 12 proteinů, z nichž jen jeden se vyskytoval u ejakulovaných spermií. Byl tedy pozorován nárůst serinové fosforylace během kapacitace. Imunofluorescenčními technikami jsme hodnotili i serinovou fosforylaci. Zde jsme našli také několik vzorů, ale nepodařilo se nám prokázat závislost mezi výskytem vzorů a stádiem maturace. Pozorovali jsme, že nejen proces kapacitace, ale obecně celá maturace spermií je úzce spojena s fosforylací na tyrozinových, a i na serinových zbytcích.

Abstract:

In order for sperm to be able to fertilize an oocyte, it must go through a maturation process. During that time qualitative changes take place on the sperm, which give the sperm fertilization ability. Maturation takes place during the passage of spermatozoa through epididymis (epididymal maturation), continues during ejaculation and also takes place in the female genital tract. There sperm undergoes capacitation. Capacitation is related to changes in the plasma membrane, but also within the sperm. These changes lead to hyparactivation of motility, and eventually to the spillage of the acrosomal vesicle. Since sperm is no longer transcriptionally active, all changes in its proteins take place through posttranslational modifications. One of these posttranslational modifications is protein phosphorylation, which can occur at tyrosine, serine and threonine residues. Phosphorylation is a process responsible for many cellular processes and it is one of the main markers of capacitation. The aim of this work was to evaluate whether boar sperm phosphorylation occurs at tyrosine and serine residues during individual maturation stages, and how this phosphorylation changes during maturation. We hypothesized that sperm at different maturation stages would undergo changes, as phosphorylation is associated with the maturation process. In this thesis, phosphorylation at tyrosine and serine residues was detected using specific antibodies. We investigated phosphorylation using immunodetection methods. We observed changes between ejaculated and capacitated sperm and sperm after acrosomal reaction. Using densitometry, we observed an increase in phosphorylation of tyrosine during capacitation and further after the acrosomal reaction. We found 10 protein bands showing tyrosine phosphorylation and in most of them we observed a significant increase in relative optical density during capacitation. Furthermore, we observed by immunofluorescence several fluorescence patterns occurring across all maturation stages. We were able to identify the pattern of tyrosine phosphorylation on the acrosomal region, in EqSS and in the flagellum, as a pattern that begins to occur more often during capacitation. Thus, tyrosine phosphorylation in these regions could be a marker of capacitation. We detected 12 protein bands showing serine phosphorylation immunodetectionally, only one of which occurred in ejaculated spermatozoa. Thus, an increase in serine phosphorylation was observed during capacitation. We also evaluated serine phosphorylation by immunofluorescence techniques. We found several patterns there, but we failed to prove the relationship between the occurrence of patterns and the stage of maturation. We have observed that not only the process of capacitation, but in general the whole maturation of sperm is closely linked to phosphorylation on tyrosine and serine residues.

Keywords

kančí spermie, maturace, fosfoserin, fosfotyrozin, fosforylace

Keywords

boar spermatozoa, maturation, capacitation, phosphotyrosine, phosphoserine

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: MVDr. Romana Krejčířová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology