Regulace plasticity povrchového fenotypu buňky a její role v rozvoji nádorového onemocnění

PharmDr. Ján Remšík, Ph.D.

Doctoral thesis

Regulation of plasticity of cell surface phenotype and its role in cancer progression

Abstract:

Fenotypová různorodost buněk v rámci jednoho nádoru se označuje jako nádorová heterogenita a je znakem probíhající klonální evoluce nádoru. Různé mechanismy (plasticita nádorových buněk, klonální evoluce a selekce) významně přispívají k progresi onemocnění, odpovědi a rezistenci k aplikované terapii. Schopnost části nádorových buněk změnit svou transkripční aktivitu a uniknout před působením terapie je překvapující a málo prozkoumaná. Nově získané schopnosti nádorových buněk, např. aktivace kmenovosti, zahájení proliferace nebo upadnutí do dormance, invazivita, či schopnost tvořit metastázy, jsou často řízené nebo doprovázené epiteliálně-mezenchymálním přechodem (EMT), který tak přispívá k nádorové plasticitě. Tyto zásadní změny v transkripčním programu se rovněž projevují změnou exprese povrchových a sekretovaných proteinů. Cílem této disertační práce je tedy blíže objasnit vztah nádorové heterogenity z hlediska exprese povrchových antigenů a odhalit mechanismy, které tyto procesy ve specifickém kontextu regulují. Navzdory současnému pokroku v léčbě primárních nádorů je metastatické onemocnění stále neléčitelné. Rozšíření nádorových buněk do vzdálených orgánů má smrtelné následky u drtivé většiny pacientů s maligními nádory. Dokonce i u pacientů s původně včas diagnostikovaným a vyléčeným, neinvazivním a nerozvinutým onemocněním dochází k vývoji metastáz, a to někdy až po několika letech a na velmi neobvyklých místech. Porozumění biologii latentních metastáz je tak jednou z největších současných výzev ve výzkumu rakoviny. Deregulace exprese proteinu Trop-2 (znaku kmenových buněk) byla dříve spojována s progresí nádoru a špatnou prognózou pacientů. V naší první studii jsme v primárních nádorech prsu a prostaty potvrdili heterogenní expresi znaku Trop-2, stejně tak jako možnost indukce plasticity Trop-2 v in vitro a in vivo podmínkách. Dále jsme potvrdili, že přítomnost proteinu Trop-2 na povrchu buněk souvisí s epiteliálním fenotypem a potlačení jeho exprese je regulováno epigeneticky prostřednictvím hypermetylace jeho promotoru nebo působením transkripčních faktorů indukujících EMT. Vysoká exprese transkriptu Trop-2 odráží dobrou prognózu pacientů a souvisí s epiteliálním fenotypem u anotovaných klinických datasetů. Detailnější porozumění jevům vedoucím k nádorové heterogenitě proteinu Trop-2 může významným způsobem přispět ke zpřesnění interpretace výsledků klinických studií testujících léčebné přístupy zaměřené na buňky exprimující ve zvýšené míře Trop-2. Význam komplexní analýzy proteinů exprimovaných na povrchu jednotlivých buněk získaných ze vzorků čerstvě izolovaných nádorů nás vedl k myšlence komplexního profilování s vysokou propustností, jež využívá validované protilátky proti povrchovým antigenům. Díky in vitro analýze detailně charakterizovaných epiteliálních bunečných linií a jejich mezenchymálních protějšků jsme identifikovali několik povrchových antigenů, které byly spojeny s epiteliálně-mezenchymální plasticitou. Následná analýza vzorků nádoru prsu průtokovým cytometrem s využitím vícebarevného značení odhalila ztrátu znaků CD9, CD29, CD49c a Integrinu β5 u jednotlivých buněk, které podstoupili EMT. CD9, člen rodiny tetraspaninových proteinů, jehož exprese byla snížena in vitro i in vivo, byl spojen s epiteliálním fenotypem nádorů, menším rizikem vývoje vzdálených metastáz a příznivou prognózou. Proto jsme došli k závěru, že exprese těchto specifických markerů odráží epiteliálně-mezenchymální plasticitu u nádorů prsu. Podobným přístupem jsme prokázali přítomnost znaku kmenových buněk Sca-1 na povrchu bazálních buněk myšího prsního ep

Abstract:

itelu a na povrchu mezenchymálních nádorových kmenových buněk. Sca-1 je jeden z nejvíce používaných povrchových znaků myších buněk s fenotypem kmenových buněk a progenitorů v různých tkáních a rovněž u buněk se schopností tvořit nádory u řady myších modelů rakoviny. I přes časté využití Sca-1 není téměř znám regulační mechanizmus řídící "zapnutí" a "vypnutí" jeho exprese či jeho udržování v rámci buněčného fenotypu. Potvrdili jsme, že exprese Sca-1 je regulována prostřednictvím cytokinů TGF-β “super rodiny”. Je známo, že buněčný sekretom hraje zásadní roli v buněčné signalizaci a komunikaci, a proto jsme zavedli vícebarevnou analýzu umožňující detekci sekretovaných látek u leukocytů, endotelií, epiteliálních a stromálních částí heterogenní nádorové tkáně. Detailní pohled do buněčného sekretomu na úrovni jednotlivých buněk umožní lepší pochopení parakrinních a autokrinních účinků sekretovaných látek. V této práci je představena nádorová heterogenita jako jedna z hlavních překážek v účinné léčbě rakoviny. Ukázali jsme, že primární nádory jsou složeny z extrémně heterogenní směsi nádorových buněk a následně jsme v podmínkách in vitro a in vivo prokázali, že epiteliálně-mezenchymální plasticita nádorových buněk k tomuto jevu významným způsobem přispívá. Podařilo se nám navíc odhalit konkrétní molekulárně biologické mechanismy, které jsou za tuto plasticitu v konkrétním kontextu zodpovědné.

Abstract:

The presence of multiple cancer cell phenotypes within a single tumor often denoted as the intratumoral heterogeneity, is a mark of ongoing ‘evolution of cancer’. Pursued by the distinct mechanisms of cancer plasticity, clonal evolution, and selection, the intratumoral heterogeneity significantly contributes to the disease progression and the response and resistance to administered therapies. Such ability of fraction of cancer cells to reprogram their transcriptional state and to escape or even evolve under the pressure of therapy is striking and not well understood. The newly developed advantages, such as the acquisition of invasive phenotype, entrance into proliferative quiescence and dormancy, activation of stem-like state and, after some time, re-awakening and formation of latent overt metastases, are often driven or accompanied by the epithelial-mesenchymal transition (EMT), a mechanism that contributes to cancer plasticity. These changes in the transcriptional program are then reflected on the cellular surface and the cocktail of secreted cellular components. For these reasons, the thesis focused on the intratumoral heterogeneity of cell surface antigen expression. Despite the recent advancements in the treatment of primary tumors, the metastatic disease is still incurable. The dissemination of cancer cells to distant organs has fatal consequences in most patients with malignant tumors. Moreover, we started to realize that even patients that were initially diagnosed and already treated with non-invasive, low-stage cancers are developing metastases years after and sometimes at very unusual sites. Understanding the biology of latent metastasis is, thus, one of the biggest challenges in cancer research. The deregulation of a stem cell marker Trop-2 in cancer cells was previously linked with the disease progression and poor prognosis. In our first study, we confirmed the presence of intratumoral heterogeneity of surface Trop-2 expression in the primary breast and prostate cancer specimens, as well as the possibility of Trop-2 plasticity induction in in vitro and in vivo settings. Next, we proved that the surface Trop-2 expression associates with an epithelial phenotype, and that its expression was suppressed epigenetically by the hypermethylation of its promoter or through the action of EMT transcription factors. The Trop-2 expression reflected patient prognosis and correlated with epithelial phenotype in the annotated clinical datasets. The events resulting in Trop-2 intratumoral heterogeneity may significantly contribute to the long-term clinical outcome to therapies targeting Trop-2-expressing cells, currently tested in clinical trials and preclinical studies. The importance of complex, single-cell-based surface phenotype analysis of fresh cancer specimens led us to the idea of high-throughput antibody-based screening platform. We identified several surface antigens that associated with epithelial-mesenchymal plasticity, denoted as the ‘ten-molecule surface signature’, in well-defined pairs of epithelial cell lines and their mesenchymal counterparts in vitro. The subsequent translation of these findings into the multicolor flow cytometric analysis of dissociated primary breast cancers led to the discovery of CD9, CD29, CD49c and Integrin β5 loss in breast cancer cells that underwent EMT in vivo. The tetraspanin family member CD9 was concordantly down-regulated in both systems and associated with the epithelial phenotype of tumors, development of distant metastases and a favorable prognosis. We propose that overall landscape of ten-molecule surface signature expression reflected the epithelial-mesenchymal plasticity in breast cancer. Using similar approach, we found that Sca-1 was expressed on the surface of a basal-like subset of murine mammary epithelial cells and mesenchymal cancer stem-like cells. Sca-1 is one of the most commonly used surface markers of murine cells with stem and progenitor phenotype in vario

Abstract:

us tissues and of the cells with tumor-initiating properties in several murine models of cancer. Despite its frequent use, the regulatory mechanisms responsible for its ‘off-and-on’ switching and cell phenotype maintenance are mostly unknown. We confirmed that its expression is modulated through the TGF-β family signaling. As the cellular secretome plays a crucial role in cell signaling and communication, we introduced a multiparametric platform, enabling analysis of secreted substances in leukocyte, endothelial, epithelial and stromal compartment of heterogeneous tissue samples. Deep insight on the cellular secretome at a single-cell resolution will enable the better understanding of a paracrine and autocrine action of secreted substances. In this thesis, we propose that the intratumoral heterogeneity is a major obstacle in effective cancer treatment. We showed that the primary tumors are comprised of an extremely heterogeneous mixture of cancer cells and provided in vitro and in vivo evidence that the epithelial-mesenchymal plasticity of cancer cells significantly contributes to this phenomenon.

Keywords

povrchový fenotyp buňky, epiteliálně-mezenchymální plasticita, nádorová heterogenita, progrese nádorového onemocnění, cell surface phenotype, epithelial-mesenchymal plasticity, intratumoral heterogeneity, cancer progression

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 1. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 15. 2. 2018
• Supervisor: Mgr. Karel Souček, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D., MUDr. Petr Džubák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology