Structure-specific endonucleases in DNA repair

Mgr. Zdenka Hašanová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Úvod. Genómová stabilita je neustále ohrozovaná exogénnymi a endogénnymi faktormi. Ochranu genetického materiálu zabezpečujú rôzne DNA opravné mechanizmy, ktoré neustále rozoznávajú a opravujú DNA poškodenia, ktorého môžu potenciálne viesť ku karcinogenéze. DNA oprava je vykonávaná rôznymi typmi enzýmov. V tejto dizertačnej práci sa zameriavame na štruktúrne špecifické endonukleázy, ktoré štiepia rôzne intermediáty, ktoré vznikajú počas DNA replikácie a homologickej rekombinácie (HR) (oprave dvojvláknových zlomov). Konkrétne, popisujeme kooperáciu medzi ľudskou štruktúrne špecifickou endonukleázou MUS81-EME1 a RecQ helikázou RECQL5β. Ďalej DNA opravné enzými musia byť striktne regulované, aby spĺňali svoju požadovanú funkciu. Jeden typ takejto regulácie je SUMOylácia, kde malý peptid (SUMO) je posttranslačne naviazaný na enzým a tým modifikuje aktivitu a funkciu daného proteínu. Charakterizovali sme úlohu SUMOylácie pri kvasinkovej štruktúrne špecifickej endonukleáze Rad1-Rad10, ktorá opravuje poškodenia počas podtypu HR a nukleotidovej excíznej opravy. Metódy. Využívali sme rekombinantné purifikované proteíny v in vitro esejach. Výsledky. MUS81 a RECQL5β fyzicky interagujú a RECQL5β stimuluje štiepenie MUS81 na rozvetvených DNA substrátoch, ktoré sú špecifické pre MUS81. RECQL5β umožňuje naviazanie MUS81 na DNA disociáciou RAD51 z jednovláknovej DNA, ktorá sa vyskytuje na neskorých replikačných intermediátoch. Ďalej sme určili pozíciu SUMOylácie Rad1 proteínu a ukázali sme, že SUMOylácia Rad1-Rad10 komplexu vedie k modifikácii DNA afinity. Okrem toho sme ukázali, že SUMO-Rad1 stimuluje SUMOyláciu jeho interakčného partnera Saw1. Záver. MUS81 a RECQL5β spolu štiepia neskoré replikačné intermediáty, čo vedie k vzniku dvojvlákonvých zlomov. SUMO modifikácia Rad1 počas DNA opravy je zodpovedná za disociáciu proteínu z DNA po rozštiepení DNA. SUMOylácia Saw1 moduluje jeho preferencie pre alternatívne DNA opravné mechanizmy nezávislé od Rad1-Rad10. Dokopy naše výsledky viacej objasňujú komplexnú funkciu a regulaciu štruktúrne špecifických endonukleáz v DNA oprave.

Abstract:

Background. Genome integrity is continuously challenged by exogenous or endogenous factors. To prevent global DNA damage potentially leading to tumorigenesis, DNA lesions need to be permanently recognized and repaired. A large set of proteins contribute to DNA repair. In this thesis we focus on structure-specific endonucleases functioning in resolution of various intermediates arising during DNA replication and the repair of double-strand breaks (DSBs) by homologous recombination (HR). In particular, we describe cooperation of human structure-specific endonuclease MUS81-EME1 with RecQ helicase RECQL5β. In addition, DNA repair enzymes also need to be tightly regulated to ensure their proper function. One such mechanism involves SUMOylation where a small peptide (SUMO) is post-translationally attached to an enzyme thus potentially modulating its activity and function. In the other part of this thesis we have identified and characterized the effect of SUMOylation on yeast structure-specific endonuclease Rad1-Rad10 operating during a HR subpathway and nucleotide excision repair. Methods. Our goals were achieved by using recombinant purified proteins in in vitro assays. Results. MUS81 and RECQL5β physically interact and RECQL5β enhances MUS81 activity by stimulating its cleavage on branched DNA substrates specific for MUS81. Further, RECQL5β enables MUS81 to access DNA by dissociating RAD51 from single-stranded DNA occurring at common fragile sites (CFSs). We designated the Rad1 SUMO conjugation-site and provide evidence that SUMOylated Rad1-Rad10 complex had modified DNA binding activities. Additionally, we found that SUMO-Rad1 enhances SUMOylation of its interaction partner Saw1. Conclusions. MUS81 and RECQL5β together process late replication intermediates and promote common fragile site expression. SUMO modification of Rad1 during DNA repair is responsible for protein turnover. SUMOylation of Saw1 modulates the preference of Saw1 for an alternative DNA repair pathway independent of Rad1-Rad10. Our studies shed more light into the complicated process and regulation of structure specific endonucleases during DNA repair.

Keywords

homologous recombination, structure-specific endonuclease, RecQ helicase, MUS81, RECQL5β, common fragile sites, Rad1-Rad10, SUMOylation, homologická rekombinácia, štruktúrne špecifické endonukleázy, RecQ helikázy, SUMOylácia

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 23. 6. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology