Míra ubiquitinace proteinů kančích spermií během post-testikulární maturace

Bc. Jitka Kudláčková

Diplomová práce

Ubiquitination rate of boar sperm proteins during post-testicular maturation

Anotace:

V průběhu post-testikulární maturace dochází k různým změnám na povrchu spermie i ve vnitřní stavbě buňky. Spermatická buňka získává řadu nových proteinů během maturace v epididymis a následně ze semenné plasmy, ale také některé proteiny ztrácí především v průběhu kapacitace. Za pomoci ubiquitin-proteazomového systému jsou z buňky odstraňovány proteiny, které spermatická buňka již nepotřebuje. K tomu, aby byl nepotřebný protein rozpoznán, musí být ubiquitinován, tj. musí se na protein navázat polyubiquitinový řetězec o čtyřech molekulách ubiquitinu. Cílem práce bylo zjistit, zda se míra ubiquitinace proteinů kančích spermií mění v průběhu epididymální maturace a v průběhu in vitro kapacitace a v kterých částech spermatické buňky ke změnám dochází. Další část práce byla zaměřena na lokalizaci proteazomu ve spermii. Pro detekci ubiquitinovaných proteinů byly použity spermie z caput a cauda epididymis, ejakulované spermie a izolované povrchové proteiny spermií kapacitovaných in vitro. Pro lokalizaci ubiquitinovaných proteinů byly použity subcelulární frakce spermií z cauda epididymis a subcelulární frakce z ejakulovaných spermií. Lokalizace proteazomu byla provedena na vzorcích epididymálních a ejakulovaných spermií. Na veškerých vzorcích byla provedena imunodetekce mono-/polyubiquitinovaných proteinů separovaných pomocí SDS elektroforézy. Výsledky byly zpracovány denzitometrickou analýzou, která ukázala nárůst ubiquitinace mezi spermiemi z caput a cauda epididymis. Naopak u kapacitovaných spermií se prokázalo snížení ubiquitinace v závislosti na délce kapacitace. K ubiquitinaci proteinů docházelo především v cytosolické a v cytoskeletální frakci spermií. Pravděpodobně se jednalo o ubiquitinaci cytoskeletálních proteinů jako například tubulinu, aktinu či spektrinu. Ubiquitinace byla prokázána i v membránové frakci, což nejspíše souvisí s degradací povrchových proteinů. Podjednotky proteazomu byly detekovány převážně v cytosolické frakci spermií. Naše výsledky ukazují, že ke změnám míry ubiquitinace proteinů v průběhu post-testikulární maturace spermií dochází, přičemž ubiquitinované proteiny byly nalezeny ve všech částech spermatické buňky.

Abstract:

Several changes on the sperm surface and in the inside structure of the cell occur during the post-testicular maturation. The sperm cell gains several new proteins during the epididymal maturation and subsequently from the semen plasma but also loses some proteins during the capacitation process. The proteins which the sperm cell does not need anymore, are removed from the cell by the ubiquitin-proteasome system. For the unneeded protein to be identified, it must be ubiquitinated, which means that the polyubiquitin chain from four molecule ubiquitin has to bind to the protein. The aim of this thesis was to find out, if the rate of ubiquitination of the boar sperm proteins changes during the epididymal maturation and during the in vitro capacitation, and in which part of the sperm cell the changes occur. The next part of the thesis was focused on the localization of the proteasome in the sperm cell. For the ubiquitinated proteins detection the sperms from the caput and cauda epididymis, ejaculated sperms and isolated surface in vitro capacitated sperm proteins were used. For the ubiquitinated proteins localization the subcellular fractions of the cauda epididymis sperms and the subcellular fraction of the ejaculated sperms were used. The localization of the proteasome was done on the samples of the epididymal and ejaculated sperms. On all the samples the immunodetection of the mono-/polyubiquitinated proteins separated by the SDS electrophoresis was done. The results were evaluated by the densitometric analysis which showed the increase of the ubiquitination depending on the length of the capacitation. The ubiquitination of the proteins occurred mostly in the cytosolic and cytoskeletal sperm fraction. Probably it was the ubiquitination of the cytoskeletal proteins, such as tubulin, actin or spectrin. Ubiquitination was proved in the membrane fraction as well, which most probably relates to the surface protein degradation. The subunits of the proteasome were detected mostly in the cytosolic sperm fraction. Our results show that the level of the protein ubiquitination changes occur during the post-testicular sperm maturation and that the ubiquitinated proteins were found in all parts of the sperm cell.

Klíčová slova

proteazom, kančí spermie, epididymální maturace, kapacitace, ubiquitin

Keywords

ubiquitin, proteasome, boar sperm, epididymal maturation, capacitation

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 7. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie