Exkretované/sekretované produkty entomopatogenních hlístic a jejich vliv na imunitu hmyzu

Bc. Sara Eliáš

Diplomová práce

Excreted/secreted products of entomopathogenic nematodes and their effect on insect immunity

Anotace:

Entomopatogenní hlístice (EPN) jsou přirození parazité hmyzu. Volně v půdě se vyskytují pouze infekční jedinci, kteří vyhledávají svého hostitele, aby mohli dokončit svůj vývojový cyklus. Mezi významné zástupce entomopatogenních hlístic patří rody Heterorhabditis a Steinernema. Důležité pro boj s hostitelem jsou jejich symbiotické bakterie (Heterorhabditis – Photorhabdus, Steinernema – Xenorhabdus). Při boji proti imunitnímu systému hmyzu hlístice využívají své exkretované/sekretované produkty (ESP), které částečně mají ve svém těle infekční jedinci a částečně jsou produkovány při dalším vývoji po průniku do těla hostitele. Tyto produkty jsou směsí molekul s různými funkcemi. Právě funkce zmíněných ESP je v této práci detailně zkoumána – konkrétně jejich vliv na fenoloxidázovou aktivitu (PO), koagulaci a antimikrobiální aktivitu. ESP byly získány ze tří izolátů dvou druhů EPN a postupně byla směs ESP dělena na jednotlivé frakce s cílem najít konkrétní aktivní složky. Nejdříve byl testován vliv ESP, z hlístic Heterorhabditis bacteriophora uskladněných různě dlouho, na PO. Jako pozitivní v inhibici se projevily hlístice 22 dní uložené u H. b. 144 a 22 a 14 dní uložené hlístice H. b. 148. Dále se pracovalo pouze s těmito vzorky. První purifikace byla provedena přes Hitrap Q, kde se molekuly rozdělily na základě náboje. Zde bylo získáno 5 frakcí od každého izolátu H. b., u kterých byla ověřena jejich aktivita v inhibici imunitních reakcí Galleria mellonella. Jako pozitivní v inhibici PO se projevily frakce 4 a 5 u H. b. 148 a 3 a 5 u H. b. 144. U koagulace byla též pozorována aktivita v inhibici, a to u obou izolátů. U H. b. 148 to byly frakce 3, 4, 5 a u H. b. 144 frakce 2 a 5. Poslední testovanou imunitní reakcí byla antimikrobiální aktivita, kde byla též pozorována inhibice frakcemi 3 a 4 u H. b. 148 a 5 u H. b. 144. U H. b. 148 byla provedena ještě druhá purifikace aktivních frakcí 4 a 5, a to Superdex 75, kde se molekuly rozdělily na základě velikosti. Bylo získáno dalších 34 (17+17) frakcí, které byly testovány na inhibici fenoloxidázy a koagulace. Jako velmi aktivní se projevily frakce 13, a to u inhibice fenoloxidázy. U koagulace byly vždy tři aktivní frakce a to 12, 15 a 17 purifikované z frakce 4, dále pak frakce 7, 10 a 17 purifikované z frakce 5. Inhibice fenoloxidázy a koagulace byla také testována u vzorku ESP izolovaného z 33 dní uskladněných hlístic Steinernema carpocapsae. Inhibice u obou imunitních reakcí byla potvrzena. Výsledky získané od obou izolátů H. bacteriophora jsou zcela nové. Takovéto testování u tohoto druhu ještě nikde nebylo publikováno. Potenciální využití výsledků je zejména v biologické kontrole hmyzích škůdců.

Abstract:

Entomopathogenic nematodes (EPNs) are the parasites of insects. Only infectious individuals are free in the soil. They are seeking for a host to complete their development cycle. Significant representatives of entomopathogenic nematodes are genus Heterorhabditis and Steinernema. Important in the fight with the host insect are symbiotic bacteria (Heterorhabditis - Photorhabdus, Steinernema – Xenorhabdus). In the fight against the immune system, insect nematodes use their excreted/secreted products (ESPs), which partly have infectious individuals in their bodies and are partially produced in further development after penetration into the body of the host. These products are a mixture of molecules with different functions. In this work is the function of the ESPs examined in detail - specifically their influence on phenoloxidase activity (PO), coagulation and antimicrobial activity. ESPs were obtained from three isolates of two types of EPN and gradually the mixture of ESP was divided into individual fractions to find specific active ingredients. Firstly, was tested the effect of ESP, from the nematode H. b. stored for a different period of time on the PO. Positive in inhibition were 22-day nematodes of H. b. 144 and 22 and 14 days stored nematodes of H. b. 148. Further, only these samples were used. The first purification was with Hitrap Q, where the molecules were separated by charge. There were 5 fractions obtained from each isolate of H. b. in which their activity in the inhibition of G. mellonella immune responses was verified. Positive in PO inhibition were fractions 4 and 5 of H. b. 148 and fractions 3 and 5 of H. b. 144. Inhibition activity was also observed for the coagulation in both isolates. For H. b. 148 fractions 3, 4 and 5 and H. b. 144 fractions 2 and 5. Lastly tested immune response was the antimicrobial activity. There were active fractions 3 and 4 of H. b. 148 and fraction 5 of H. b. 144. In the second step, a second purification of active fractions 4 and 5 of H. b. 148 was carried out, namely Superdex 75, where the molecules were subdivided by size. A further 34 (17 + 17) fractions were obtained and they were tested for an inhibition of phenoloxidase and coagulation. Very highly active fractions 13 were manifested in the inhibition of phenoloxidase. In coagulation, there were three active fractions, 12, 15 and 17 purified from fractions 4 and fractions 7, 10 and 17 purified from fraction 5. Phenoloxidase and coagulation inhibition were also tested on ESP isolated from 33 days stored nematodes of Steinernema carpocapsae. The inhibition of both immune responses was confirmed. The results obtained from both H. b. isolates are quite new. Such testing of this species has not been published yet. Potential use of the results is mainly in the biological control of insect pests.

Klíčová slova

Exkretované/sekretované produkty, Heterorhabditis bacteriophora, fenoloxidáza, koagulace, antimikrobiální aktivita, inhibice.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 1. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 2. 2018
• Vedoucí: doc. RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
• Oponent: RNDr. Vladimír Půža, Ph.D

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Speciální biologie