Úloha reaktivních forem dusíku v regulaci aktivity enzymů S-nitrosylací u hrachu setého

Bc. Kateřina VRBOVÁ

Bakalářská práce

The role of reactive nitrogen species in regulation of enzyme activities by S-nitrosylation in pea (Pisum sativum)

Anotace:

Reaktivní formy dusíku (RNS) a kyslíku (ROS) jsou signální molekuly, které v rámci reakce na biotický či abiotický stres spouští řadu obranných reakcí. Největší význam v signálních drahách RNS má S nitrosylace, posttranslační modifikace proteinů, která spočívá v připojení nitroso skupiny (-NO) na cílové cysteinové residuum proteinu, což má za následek změnu jeho aktivity a funkce. Cílem bakalářské práce bylo ověření možné regulace enzymů katabolismu polyaminů, aminoaldehyddehydrogenasy (AMADH) a diaminoxidasy (DAO) S-nitrosylací. Pro studium byly použity hrachové rekombinantní enzymy PsAMADH1 a PsAMADH2, vyizolovaný enzym PsDAO a 7denní rostliny dvou kultivarů hrachu setého (Pisum sativum cv. Kudrnáč a Pisum sativum cv. Twinset). Jako donory NO byly aplikovány S nitrosoglutathion (GSNO), nitroprussid sodný (SNP) a S nitroso N acetylpenicilamin (SNAP), které se liší intenzitou uvolnění NO. V korelaci s výsledky z predikční studie byl zaznamenán inhibiční efekt donorů NO na aktivitu enzymů PsAMADH, zatímco aktivita PsDAO nebyla v důsledku zvýšené koncentrace NO ovlivněna. Inhibiční efekt NO na PsAMADH aktivitu byl detekován i po aplikaci donorů NO k růstovému médiu, ve kterém se nacházely 7denní rostliny hrachu setého. Regulace aktivity AMADH S-nitrosylací byla potvrzena nepřímo reakcí s redukčními činidly, jako je glutathion a dithiotreitol. V následujících experimentech je nutné regulaci AMADH S-nitrosylací dále potvrdit např. metodou biotin-switch v kombinaci s hmotnostní spektrometrií.

Abstract:

Reactive nitrogen species (RNS) and reactive oxygen species (ROS) are signaling molecules that trigger a number of defense responses during biotic or abiotic stress. The highest importance in RNS signaling pathways plays post-translational modifications of proteins including S-nitrosylation, consists in attaching a nitroso group (-NO) to a corresponding cysteine residue of target protein, resulting in a change in its activity and function. The aim of this thesis was to verify possible regulation by S-nitrosylation of aminoaldehyde dehydrogenase (AMADH) and diaminoxidase (DAO), key enzymes of polyamine catabolism. Two pea recombinant enzymes PsAMADH1 and PsAMADH2, the isolated PsDAO enzyme and 7-days plants of two pea cultivars (Pisum sativum cv. Kudrnáč and Pisum sativum cv. Twinset) were used for the study. Different nitric oxide (NO) donors were tested: S nitrosoglutathione (GSNO), sodium nitroprusside (SNP) and S nitroso N acetylpenicillamine (SNAP). In correlation with the results of the bioinformatic prediction study, the inhibitory effect of NO donors on the activity of PsAMADH enzymes was observed, while PsDAO activity was not affected. The inhibitory effect of NO on PsAMADH activity was also detected after application of NO donors to the growth medium of 7-days pea plants. Regulation of AMADH activity by S-nitrosylation was confirmed indirectly by reaction with reducing agents such as glutathione and dithiothreitol. In the following experiments it is necessary to further confirm the AMADH regulation by S-nitrosylation, e.g. by biotin-switch method in combination with mass spectrometry.

Klíčová slova

Pisum sativum, aminoaldehyddehydrogenasa, diaminoxidasa, reaktivní formy dusíku, oxid dusnatý, reaktivní formy kyslíku, polyaminy, S-nitrosylace

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 6. 2019
• Vedoucí: doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie