Proteiny AKAP a jejich zapojení během kapacitace kančích spermií

Bc. Veronika Forstlová

Master's thesis

AKAP proteins and their involvement in capacitation of boar sperm

Abstract:

Proteiny rodiny AKAP jsou skupinou strukturně odlišných proteinů se společnou funkcí vázat se na regulační podjednotky cAMP dependentní proteinkinázy A (PKA). Vazbou PKA na AKAP proteiny dochází k lokalizaci PKA do místa jejího katalytického působení k zajištění fosforylace cílových substrátů. Bylo popsáno již více než 20 proteinů rodiny AKAP. U lidských spermií je nejvíce zastoupeným proteinem ve spermiích protein AKAP4. Protein AKAP4 je lokalizován do fibrózní pochvy hlavní části bičíku spermie a hraje důležitou roli, jak při samotné stavbě fibrózní pochvy, tak i při regulaci motility spermií. AKAP4 protein je nezbytným pro koordinaci signální dráhy PKA a fosforylaci motorických proteinů spermie (dyneinů), čímž podporuje klouzání jednotlivých mikrotubulů v dubletu axonemy, a tak ovlivňuje samotnou motilitu spermií. U AKAP4 knockoutovaných jedinců vede absence proteinu AKAP4 k nekoordinovanému pohybu bičíku a snížení motility spermie, dále také dochází k výraznému narušení struktury samotného bičíku. U člověka je protein AKAP4 považován za vhodný marker kvality spermií. Přesná úloha proteinu AKAP4 v regulaci procesů probíhajících v kančích spermiích nebyla doposud detailně popsána. Cílem této diplomové práce bylo ověřit hypotézu, že protein AKAP4 je zapojený do regulace procesů, které probíhají během kapacitace kančích spermií. K ověření této hypotézy byl protein AKAP4 detekován metodou Western blot v ejakulovaných spermiích, v kančích spermiích po in vitro kapacitaci a v kančích spermiích po in vitro indukované akrozomové reakci a byla zhodnocena změna relativní denzity signálu proteinu AKAP4. Provedenými experimenty se podařilo detekovat protein AKAP4 u ejakulovaných kančích spermií, u kančích spermií po in vitro kapacitaci i u kančích spermií po in vitro navozené akrozomové reakci. Ve všech typech vzorků byl detekován jak protein AKAP4, tak i jeho izomer proAKAP4. Byly patrné statisticky významné rozdíly v detekci relativní denzity signálu mezi jednotlivými kanci, což může odrážet rozdíly fertility u jednotlivých kanců. U všech testovaných kanců byl nepatrný pokles relativní denzity signálu proteinu AKAP4 u vzorků spermií po in vitro navozené akrozomální reakci, oproti vzorkům spermií po in vitro kapacitaci. Tento výsledek podporuje stanovenou hypotézu, že proteiny AKAP4 jsou zapojené do regulace procesů probíhajících během kapacitace kančích spermií.

Abstract:

AKAP family proteins are a group of structurally distinct proteins with a common function to bind to the regulatory subunits of cAMP-dependent protein kinase A (PKA). Binding of PKA to AKAP proteins localizes PKA to its catalytic site of action to ensure phosphorylation of target substrates. More than 20 proteins of the AKAP family have been reported. In human sperm, the most abundant protein in sperm is AKAP4 protein. AKAP4 protein is localized to the fibrous sheath of the main part of the sperm flagellum and plays an important role both in the construction of the fibrous sheath itself and in the regulation of sperm motility. The AKAP4 protein is essential for the coordination of the PKA signaling pathway and phosphorylation of sperm motor proteins (dyneins), thereby promoting the sliding of individual microtubules in the axoneme doublet and thus affecting sperm motility itself. In AKAP4 knockout individuals, the absence of AKAP4 protein leads to uncoordinated flagellar movement and reduced sperm motility, as well as a marked disruption of the flagellar structure itself. In humans, AKAP4 protein is considered a suitable marker of sperm quality. The exact role of AKAP4 protein in the regulation of processes occurring in boar spermatozoa has not yet been described in detail. The aim of this thesis was to test the hypothesis that the AKAP4 protein is involved in the regulation of processes that take place during boar sperm capacitation. To test this hypothesis, AKAP4 protein was detected by Western blot in ejaculated sperm, in boar sperm after in vitro capacitation and in boar sperm after in vitro induced acrosome reaction and the change in the relative signal density of AKAP4 protein was evaluated. The experiments performed were successful in detecting AKAP4 protein in ejaculated boar spermatozoa, in boar spermatozoa after in vitro capacitation and in boar spermatozoa after in vitro induced acrosome reaction. Both AKAP4 protein and its isomer proAKAP4 were detected in all sample types. Statistically significant differences in the detection of relative signal density between boars were evident, which may reflect differences in fertility between boars. In all boars tested, there was a slight decrease in the relative signal density of the AKAP4 protein in sperm samples after in vitro induced acrosomal reaction, compared to sperm samples after in vitro capacitation. This result supports the established hypothesis that AKAP4 proteins are involved in the regulation of processes occurring during boar sperm capacitation.

Keywords

proAKAP4, AKAP4, kapacitace, motilita, spermie

Keywords

proAKAP4, AKAP4, capacitation, motility, sperm

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Ing. Tereza Krejčová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology