Antimikrobiální látky produkované bakteriemi rodu Bacillus

Bc. Marie Pruchová

Master's thesis

Antimicrobial substances of the genus Bacillus

Abstract:

Bakterie rodu Bacillus jsou producenty široké škály antimikrobiálních látek s potenciálem pro využití v lékařství, zemědělství a potravinářském sektoru. Proto byla cílem diplomové práce charakterizace čtyř produkčních kmenů Bacillus sp. izolovaných z různých prostředí, testování jejich antimikrobiální aktivity a určení povahy antagonisticky působících látek. Identifikace kmenů byla provedena metodami MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie a sekvenováním 16S rDNA. U kmenů skupiny B. cereus byl metodou PCR a fenotypovými testy stanoven patogenní potenciál. Antimikrobiální aktivita byla testována agarovou difúzní metodou proti potenciálně patogenním bakteriím, bakteriím způsobujícím kažení potravin a probiotickým bakteriím. Povaha aktivní látky byla studována vystavením supernatantů různým enzymům, teplotám a hodnotám pH. U kmene 1 byla také stanovena fáze iniciace exprese a fáze maximální produkce antimikrobiální látky. Dále byl studován vliv kultivační teploty na expresi inhibiční látky a stimulována exprese prostřednictvím nisinu, mitomycinu C a supernatantu z lecitináza-pozitivních bakterií. Detailněji byla zjišťována povaha antimikrobiální látky, a to účinkem surfaktantů a různých podmínek skladování. Také byl zkoumán její vliv na buňky. Pro citlivé kmeny byla stanovena minimální inhibiční a baktericidní koncentrace supernatantu mikrodiluční metodou. Všechny kmeny byly identifikovány jako Bacillus, kmen 1 jako B. weihenstephanensis, kmen 2 jako B. proteolyticus, kmeny 3 a 4 jako B. tequilensis. U kmene 1 byla zjištěna přítomnost genů pro 2 virulentní faktory, lecitinázu C a nehemolytický enterotoxin, projevil se slabou lecitinázovou aktivitou. U kmene 2 byl zjištěn výrazně vyšší patogenní potenciál, projevil se silnou lecitinázovou aktivitou a je hemolytický. Všechny kmeny vykázaly antimikrobiální aktivitu, shodně inhibovaly vysoce patogenní bakterie Bacillus cereus, Clostridium perfringens a Listeria monocytogenes. B. tequilensis 3 a 4 účinkovali také vůči Bacillus fusiformis, Clostridium butyricum a Cl. dificille, a kmen 4 navíc vůči Micrococcus luteus. U všech kmenů byla zjištěna proteinová povaha aktivních látek. Zatímco u kmenů B. cereus (kmeny 1 a 2) byla aktivita inhibována pouze proteinázou K, u kmenů skupiny B. subtilis (kmeny 3 a 4) i pepsinem po 24h působení. Všechny látky byly vysoce odolné vůči vysokým teplotám (až 100 °C po dobu 1h) a aktivní v širokém rozmezí hodnot pH. U B. weihenstephanenis 1 byla exprese antimikrobiální látky zahájena na konci exponenciální fáze a maximálních hodnot bylo dosaženo při přechodu do fáze stacionární. Optimální teplota kultivace pro dosažení maximální produkce byla stanovena na 30 °C, přičemž na expresi neměla vliv žádná z antimikrobiálních látek ani supernatant z lecitináza-pozitivních bakterií. Antimikrobiální látka si zachovala stabilitu i během dlouhodobém skladování (1 měsíc) za vysokých teplot 30 a 37 °C. Bylo zjištěno, že aktivní látka účinkuje baktericidně, ačkoliv se zdá, že nepůsobí bakteriolyticky. Při nižších koncentracích působí bakteriostaticky. U citlivých kmenů byla stanovena minimální inhibiční a baktericidní koncentrace. Nejnižší MIC a MBC byly naměřeny u anaerobně kultivovaného B. cereus CCM 2010 (titr 32). S ohledem na zmíněné vlastnosti, je antimikrobiální látkou pravděpodobně cyklický bakteriocin. Taková látka by mohla nalézt uplatnění v potravinářském průmyslu při konzervaci potravin nebo jako léčivo. Stejně tak antimikrobiální látky ostatních kmenů budou pro svůj velký potenciál dále studovány. Také bude pozornost zaměřena na nepatogenní kmeny, které by mohly být využity například jako probiotika k modulaci mikrobioty trávicího traktu a jako prevence pro

Abstract:

ti střevním infekcím nebo jako silážní inokulanty.

Abstract:

Some Bacillus spp. produce a variety of antimicrobials with potential for use in medicine, agriculture and food industry. Therefore, the aim of the diploma thesis was to characterize four strains of Bacillus sp. isolated from various environments, testing their antimicrobial activity and determination of the nature of antagonistic compounds. Identification of the strains was performed by MALDI-TOF mass spectrometry and 16S rDNA sequencing. Pathogenic potential of B. cereus strains was studied by PCR and phenotypic assays. Antimicrobial activity was tested by agar well diffusion method against potentially pathogenic bacteria, food spoilage bacteria and probiotic bacteria. The nature of the active substance was studied by exposing supernatants to various enzymes, temperatures and pH values. The growth phase of strain 1 when active agent begins to be expressed and phase of maximum production were determined. Effect of cultivation temperature on the expression of the inhibitory substance, and stimulation of expression by nisin, mitomycin C and supernatants from lecithinase-positive bacteria were also studied for this strain. The nature of antimicrobial compound was investigated in more detail by effects of surfactants and different storage conditions. Its effect on cells was also investigated. For sensitive strains, the minimum inhibitory and bactericidal concentrations of the supernatant were determined by the microdilution method. All strains were identified as Bacillus, strain 1 as B. weihenstephanensis, strain 2 as B. proteolyticus, strains 3 and 4 as B. tequilensis. Strain 1 showed the presence of genes coding 2 virulence factors, lecithinase C and non-hemolytic enterotoxin, with weak lecithinase activity. Strain 2 had significantly higher pathogenic potential, it showed strong lecithinase and hemolytic activity. All strains inhibited the highly pathogenic bacteria Bacillus cereus, Clostridium perfringens and Listeria monocytogenes, B. tequilensis 3 and 4 also acted against Bacillus fusiformis, Clostridium butyricum and Cl. dificille and strain 4 in addition Micrococcus luteus. It was found that active substances of all strains tested were of proteinaceous nature. Whereas activity of B. cereus strains (strains 1 and 2) was inhibited only by proteinase K, activity of B. subtilis strains (strains 3 and 4) also by pepsin after 24 h of treatment. All antimicrobial compounds were highly resistant to high temperatures (up to 100 ° C for 1 hour) and active in a wide range of pH values. In B. weihenstephanenis 1, antimicrobial agent began to be expressed at the end of exponential phase and the maximum values were reached during the transition to the stationary phase. The optimal culture temperature for maximal production was determined at 30 °C. No antimicrobials or supernatants from lecithinase-positive bacteria affected expression. The antimicrobial substance retained its stability even during long-term storage (1 month) at high temperatures of 30 and 37 °C. The active substance was found to have bactericidal, at lower concentrations bacteriostatic effect, and it did not appeared to be bacteriolytic. Minimum inhibitory and bactericidal concentrations were determined for sensitive strains. The lowest MIC and MBC were observed in anaerobically cultured B. cereus CCM 2010 (titer 32). It can be assumesd that antimicrobial agent of B. weihenstephanensis 1 is a cyclic bacteriocin. Such substance could be used in the food industry as a preservative, for pharmaceutical purposes or as a medicine. Likewise, antimicrobials of other strains will be further studied for their great potential. Attention will also be focused on non-pathogenic strains which could be used, as probiotics modulation of the gastrointestinal microbiota, as a prevention against infections or as silage inoculants.

Keywords

antimikrobiální aktivita, sekundární metabolismus, bakteriociny, antibiotika, patogenní potenciál, Bacillus

Keywords

Bacillus, antimicrobial activity, secondary metabolism, bacteriocins, antibiotics, pathogenic potential

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Hana Šubrtová Salmonová, Ph.D.
• Reader: Hana Sechovcová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Animal Science / Animal Nutrition and Dietology