Vliv přítomnosti TRF2 na funkci jiných DNA vazebných proteinů

Bc. Milan Hluchý

Master's thesis

Effects of protein TRF2 on function of other DNA binding proteins

Abstract:

Telomery jsou nukleoproteinové struktury na koncích eukaryotických chromozomů. Telomerickou DNA tvoří tandemové repetice se sekvencí 5‘-TTAGGG-3’. Telomery jsou chráněny proteinovým komplexem nazývaným shelterin. Shelterin se skládá ze šesti podjednotek. Centrální roli v shelterinu hraje protein TRF2. Protein TRF2 je DNA-vazebný protein, který koordinuje proteiny účastnící se správného fungování telomer. Jednou z netelomerických funkcí proteinu TRF2 je ochrana proteinu REST před polyubikvitinací a degradací v proteazomu. Aktivní protein REST se nachází v promotorech genů souvisejících s diferenciací a dozráváním neuronů a epigeneticky je umlčuje. Cílem této práce byla identifikace domén, které jsou zodpovědné za interakci mezi proteiny TRF2 a REST. Zkrácené verze obou proteinů byly vloženy do dvou různých vektorů a jejich exprese v buňkách E. coli byla optimalizována. Purifikované proteiny byly použity v in vitro studiích, konkrétně v pull-down pokusech a měřeních SPR (z angl. Surface Plasmon Resonance, rezonance povrchového plazmonu), k vymezení interagujících úseků a určení jejich vazebné afinity. Interakční doména proteinu REST se nachází v C-koncové části proteinu. Protein TRF2 interaguje s proteinem REST prostřednictvím koncové části dimerizační domény a přes Rap1-vazebnou doménu.

Abstract:

Telomeres are nucleoprotein structures found at the ends of eukaryotic chromosomes. Telomeric DNA consists of tandem repetitions with 5‘-TTAGGG-3’ sequence. Telomeres are protected by a protein complex called shelterin. Shelterin complex consists of six subunits. Central role on shelterin is played by TRF2 protein. TRF2 is a DNA-binding protein that acts as a scaffold for multiple proteins which are important for proper functions of telomeres. One of several non-telomeric functions of TRF2 is the protection of REST protein from polyubiquitination and proteasomal degradation. Active REST proteins are found in promoters of genes linked to differentiation and maturation of neurons and is epigenetically silencing them. This work focuses on identification of the domains responsible for TRF2-REST interaction. Truncated versions of both proteins were cloned into different vectors and their expressions in E. coli cells were optimized. Purified proteins were used for in vitro studies, namely pull-down assay and SPR (Surface Plasmon Resonance) measurements, to determine the interacting regions and quantify the affinity of their binding. The interacting region on REST was found in the C-terminal part of the protein. TRF2 is interacting with REST via the distal part of the dimerisation domain and Rap1-binding motif.

Keywords

telomery, shelterin, TRF2, REST, pull-down, SPR, netelomerická funkce, interakční doména, telomeres, non-telomeric function, interacting domain

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 13. 6. 2014
• Supervisor: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics