Tyrosinová fosforylace býčích spermií ve vztahu k jejich kryokonzervaci

Bc. Hana Baťková

Master's thesis

Tyrosine phosphorylation in bovine spermatozoa in relation to their cryopreservation

Abstract:

K oplození schopnosti býčích spermií je nezbytné, aby podstoupily kapacitaci a s ní spojené biochemické a biofyzikální dráhy probíhající na plazmatické membráně a uvnitř spermie. Mezi tyto dráhy patří tyrosínová fosforylace (PTP), akrozomová reakce a hyperaktivace. Tyrosinová fosforylace je jeden z nejvyužívanějších a nejlepších markrů kapacitace. Pro spuštění tyrosínové fosforylace je nezbytný influx extracelulárního vápníku a hydrogenuhličitanu a eflux cholesterolu z plazmatické membrány. Vápník a hydrogenuhličitan spustí dráhu přes rozpustnou adenyl cyklázu (sAC), cyklický adenosinmonofosfát (cAMP), protein kinázu A (PKA) až po fosforylaci tyrosín kynázy za pomocí ATP a NO. Takto probíhají dráhy vedoucí ke kapacitaci za fyziologických podmínek. Pokud spermie vystavíme kryokonzervaci, jsou především narušeny struktury na plazmatické membráně a následně spuštěny chybné procesy a může být také zahájena předčasná kapacitace. Kryokapacitace je nežádoucí, protože spermie poté mají sníženou životaschopnost a fertilizaci. Obsahem této práce je literární rešerže popisující stavbu býčí spermie, proces kapacitace a kryokonzervaci a její vlivy na spermie. Cílem experimentální části práce bylo zjistit rozdíly v tyrosinové fosforylaci mezi nativními spermiemi a po kryokonzervaci. Byl stanoven předpoklad, že kryokonzervace bude ovlivňovat výši PTP jako jednoho z markerů kapacitace. Ejakulát byl odebírán šesti býkům standardním způsobem na inseminační stanici. Nativní ejakulát i kryokonzervovaný byl následně použit pro nepřímou imunofluorescenční metodu stanovení TyrP a k extrakci proteinů. Extrakované proteiny byly pročištěny přes hustotní gradient a následně použity do SDS-elektroforézy. U každého vzorku byla provedena kontrola motility, která potvrdila dostatečnou kvalitu spermií pro experiment. Naše výsledky potvrzují, že spermie vykazují tyrosinovou fosforylaci neprodleně po rozmražení. Nepřímá imunofluorescenční metoda prokázala vysokou tyrosinovou fosforylaci ve středním stupni u kryokonzervovaných býčích spermií. Kontrolní skupina kapacitovaných spermií nám ověřila normálně probíhající kapacitaci, kde byly vyšší hodnoty u všech pozorovaných stupňů tyrosinové fosforylace. Zjištěné hodnoty intenzity proteinů pomocí kalibračních křivek z membrány nebyly pro všechny vzorky shodné. Z celkových výsledků je možné inferovat, že jsou přítomny rozdíly mezi býčími spermiemi v nativním stavu a po kryokonzervaci. Kryokonzervace má vliv na spuštění tyrosinové fosforylace a na kapacitaci předčasně probíhající na spermiích.

Abstract:

In order to be fertile it is neccasary for bull sperms to undergo capatication and related biochemical and biophysical paths going in plasmatic membrane and insinde of sperm. Tyrosine phosporylation (PTP), acrosome reaction and hyperactivation belong among these paths. Tyrosine phosporylation is one of the most used and best markers of capatication. In order to trigger tyrosine phosporylation is necessary to influx extracelluar calcium and hydrogencarbonate and eflux of cholesterol from plasmatic membrane. Calcium and hydrogencarbonate trigger the path across soluble adenyl cyclosis (sAC), cyclic adenosinmonofosfat (cAMP), protein kinase A (PKA) up to phosphorylation of thyrosins kinase with help of ATP and NO. This is the process of the paths leading to capatication under physologic conditions. The structures of plasmatic membrane might be disrupted if the sperms are exposed to cryopresevation, which could subsequently trigger faulty processes and early capacitation. Cryocapacitation is not desirable as the sperms might have decreased vitality and fertilization. The thesis contain literal research describing structure of bull sperm, process of capacitation and cryopreservation and their influences on sperm. The goal of the experimental part of the thesis is to find out the differences in tyrosine phosporylation between native sperms and sperms after cryopreservation. An assumption has been set that cryopreservation will influence the amount of PTP as one of the markers of capacitation.The ejaculate was taken out of six bulls by standard method at insemination station. Both native and cryopreservation ejaculate were then used for indirect imunofluorescense method to determine PTP and to protein extraction. Extracted proteins were cleaned through density gradient and used for SDS electrophoresis afterwards. Each sample has been checked for motility to confirm sufficient quality of the sperms. Our records confirm that the sperms show tyrosine phosporylation immediately after defrosting. Indirect imunofluorescense method proved high tyrosine phosporylation at medium level in cryopreservation bull sperms. The control group of capacitated sperms have verified the standard process of capacitation, where we obtained higher values at all observed levels of tyrosine phosporylation. The values of protein intesnity found out using calibration curves from the membrane were not identical for all of the samples. Out of the final results we can identify existing differences between bull sperms in native condition and after cryopreservation. The cryopreservation has an influence on triggering tyrosine phosporylation and on early capacitation going on the sperms.

Keywords

spermie, tyrosin, fosforylace

Keywords

sperm, tyrosine, phosphorylation

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Ondřej Šimoník

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology