Funkce antioxidačních enzymů a substrátů ve fotosyntéze lišejníků za stresových radiačních podmínek

Bc. Kristýna Večeřová, Ph.D.

Diplomová práce

Anotace:

Lišejníky jsou symbiotická spoleenství houby (mykobiont) a fotosyntetického partnera (fotobiont), kterým mže být asa nebo sinice. Dokáží pežít v extrémních podmínkách díky svojí schopnosti vyrovnat se s nepíznivými podmínkami prostedí jako je nedostatek vody, rychlé a extrémní zmny teplot, dlouhotrvající pokrývka snhu. Svtlo jako zdroj energie pro fotosyntézu je nezbytné pro rst lišejník a tvorbu biomasy. Na druhou stranu nadbytek svtla dokáže inhibovat fotosyntézu a mže vést k fotooxidativní destrukci fotosyntetického aparátu. Lišejníky mají nkolik antioxidaních mechanism, kterými se snaží zabránit negativním zmnám fotosyntetického aparátu vlivem vysokého záení. Mezi typické antioxidaní látky indukované v lišejnících záením patí glutation (GSH), kyselina askorbová a pigmenty xantofylového cyklu. V lišejnících se vyskytují i antioxidaní enzymy, které se podílejí na zneškodnní volných radikál (zejména rzných forem reaktivního kyslíku, ROS), které se ve zvýšené míe produkují pi vystavení stélky lišejníku vysokým hodnotám viditelného, popípad UV záení. Mezi cíle mé diplomové práce patilo posouzení vlivu krátkodobého a dlouhodobého ovlivnní vysokým záením a jejich kombinace na fotosyntetický aparát a fotoprotekci lišejníku Lasallia pustulata a sledování dynamiky pigment xantofylového cyklu, glutationu a antioxidaních enzym za svtelného stresu u tohoto lišejníku. Stélky byl ovlivnny krátkodobým silným záením, tj. byly vystaveny záení o intenzit 1800 ľmol m-2 s-1 na 30 min, piemž zotavení stélek do pvodního stavu po probhlém ovlivnní probíhalo v šeru. Druhým experimentálním ovlivnním bylo vystavení vzork kontinuálnímu záení o intenzit 600 ľmol m-2 s-1 po dobu 5 dn. Tetí experimentální ovlivnní bylo kombinací obou dvou pedchozích. Stélky byly vystaveny kontinuálnímu záení o intenzit 600 ľmol m-2 s-1 po dobu 5 dn a souasn každých 24 h svtlu o intenzit 1800 ľmol m-2 s-1 na 30 min. Do tvrtého ovlivnní se nezahrnulo psobení dlouhodobého kontinuálního svtla. Tyto stélky byly 5 dn ponechány ve tm a každých 24 h byly na 30 min vystaveny záení o intenzit 1800 ľmol m-2 s-1. Pro posouzení stavu fotosyntetického aparátu byly vypoítány parametry fluorescence chlorofylu a z pomalé kinetiky fluorescence chlorofylu a doplnné saturaními pulsy. Souasn s mením fluorescence chlorofylu byly odebírány vzorky pro biochemická stanovení antioxidant. Mrazov vysušené a rozemleté vzorky byly použity pro extrakci pigment xantofylového cyklu, glutationu a antioxidaních enzym katalázy a askorbát peroxidázy. Stélky ovlivnné krátkodobým silným záením vykázaly ihned po ovlivnní výrazný vzrst DEPS (definována jako de-epoxidaní stav pigment xantofylového cyklu) vzhledem ke kontrole. Po umístní stélek na mírném svtle hodnota DEPS poklesla na pvodní hodnotu. Bhem dlouhodobého svtelného ovlivnní došlo k postupnému nárstu DEPS, piemž nejvtší vzrst DEPS následoval bhem 24 h psobení záení. Kombinované svtelné ovlivnní (tj. dlouhodobé s opakujícím se krátkodobým) nevedlo ke statisticky významnému rozdílu hodnot DEPS oproti samostatnému dlouhodobému ovlivnní. Z výsledk mení stélek umístných ve tm a ovlivovaných opakovaným krátkodobým svtlem bylo zjištno, že se DEPS vzork bhem 24 h po ovlivnní vrátilo vždy na pvodní neovlivnnou hodnotu. Parametr fluorescence chlorofylu FV/FM, který vyjaduje potenciální kapacitu fotochemických proces v PSII (tedy úinnost pokud jsou všechna PSII centra otevená), klesl po krátkodobém radianím ovlivnní, nicmén se rychle vrátil na pvodní hodnoty. Bhem kontinuálního ovlivnní hodnoty FV/FM poklesly nejvýraznji v prvních 24 h, poté byla rychlost poklesu mnohem pomalejší. Ve stélkách umístných ve tm vedlo opakované krátkodobé radianí ovlivnní k postupnému poklesu

Anotace:

Fv/FM, které se nevrátilo bhem 24 hodin následujících po ovlivnní k pvodním hodnotám. To naznauje kumulativní efekt svtelného ovlivnní. Ten je patrný také u parametru NPQ, ale pouze u stélek umístných ve tm. Ve všech typech ovlivnní došlo k rychlému nebo pomalému nárstu NPQ vlivem vysokého svtla. Obsah glutationu bhem ovlivnní záením byl tém konstantní a odpovídal rozsahu uvádnému pro jiné druhy lišejník. Aktivity antioxidaních enzym nevykázaly zjevné trendy v žádném typu ovlivnní. Tato zjištní bude nutné ovit dalšími experimenty. Z výsledk vyplývá, že kapacita fotoochranných mechanism u studovaného lišejníku je dostatená pro rychlou reakci fotosyntetického aparátu fotobionta na krátkodobý intenzivní radianí stres a lze pedpokládat, že má dostatené zásoby antioxidaních substrát a enzym. Pokud je lišejník L. pustulata vystaven radianímu stresu dlouhodob, nezáleží na míe stresu nebo na zmny parametr fluorescence chlorofylu má vtší vliv délka psobení radianího stresu než absolutní síla ozáení.

Abstract:

Lichens are organisms formed by symbiotic association of fungi (mycobiont) and photosynthetic partner (photobiont), which can be algae or cyanobacterium. They can survive in extreme conditions due to their ability to cope with unfavourable conditions of environment such as e.g. lack of water, rapid and extreme changes of thallus temperature, long-lasting snow cover. Sun light as a source of energy for photosynthesis is essential for lichen growth and biomass production. Nevertheless, too high dose of light can inhibit photosynthesis and can lead to photooxidative destruction of photosynthetic apparatus. To avoid high-light induced negative changes in photosynthetic apparatus, lichens possess several antioxidative mechanisms. Glutathione (GSH), ascorbic acid and pigments of xanthophyll cycle belong among the typical antioxidative compounds induced by high light in lichens. In lichens, there are also several antioxidant enzymes, which participate in scavenging of free radicals (especially reactive oxygen species, ROS). ROS are produced in lichen thalli under high light, eventually under UV radiation. The aim of my diploma thesis was to evaluate short-term and long-term effects of high light on the photochemical processes of photosynthesis and photoprotective antioxidative mechanisms in foliose lichen Lasallia pustulata. Another objective was to evaluate the dynamics of xanthophyll cycle pigments, glutathione and antioxidative enzymes in the lichen under high light stress. Lichen thalli were treated by short-term high light, i.e. they were placed under light source of intensity of 1800 ľmol m-2 s-1 for 30 min, whereas recovery of samples towards the initial state took place in a shade. The second experimental treatment was the exposure to long-term continuous light of 600 ľmol m-2 s-1 for 5 days. The third treatment was combination of the above two. Lichen thalli were exposed to long-term continuous light of 600 ľmol m-2 s-1 for 5 days and, simultaneously, each 24 h to light of intensity of 1800 ľmol m-2 s-1 for 30 min. In the fourth treatment, long-term continuous light was not included. Samples were left in dark for 5 days and exposed to light of 1800 ľmol m-2 s-1 for 30 min every 24 h. For determination of actual state of photosynthetic apparatus during the above-specified treatments, chlorophyll a fluorescence parameters were measured. For this purpose, analysis of slow chlorophyll fluorescence kinetics with addition of saturation pulses was done. Simultaneously with the measurements of chlorophyll a fluorescence, samples for biochemical analysis of antioxidants were collected. Freeze-dried and grinded samples were used for extraction of xanthophyll cycle pigments, glutathione and antioxidative enzymes catalase and ascorbate peroxidase. Thalli treated by the short-term high light showed a high increase of DEPS values (defined as a de-epoxidation state of xanthophyll cycle pigments) immediately after the exposure. DEPS values decreased to original one after placing the thalli under mild light. During the long-term light treatment, DEPS values increased gradually, the majority of the increase appeared during the first 24 h of exposure to light. Combinated light treatment (i.e. long-term continuous light with repeated short-term high light episodes) did not lead to statistically significant difference in DEPS, when compared to long-term continuous treatment. In samples placed in the dark and repeatedly treated by short-time light, DEPS increased shortly after and then recovered to the initial state during 24 h after exposure to light. Chlorophyll a fluorescence parameter Fv/FM, which represents the potential capacity of photochemical processes in PSII (i.e. effect if all centers of PSII are open), decreased after short-term exposure to light. However, it returned quickly to initial values during subsequent recovery under mild light. During the long-term treatment under continuous light, Fv/FM values decreased substantially

Abstract:

in the first 24 h and then the rate of decrease was found much slower. In thalli exposed to repeated short-term high light, Fv/FM decreased to such an extent that it did not recover during next 24 h. This finding suggests cumulative effect of repeated high light treatment. This was evident also for NPQ parameter, but only in samples placed in the dark. In all types of treatments, NPQ increased rapidly in thalli under high light. Contents of glutathione was almost constant throughout the light treatments and fit well to the range reported for other lichen species. Activities of antioxidative enzymes did not show apparent trends in any type of treatment. However, these findings must be verified by further experiments. Our results showed that lichen L. pustulata can deal with high light short-term stress very effectively due to its sufficient capacity of antioxidant substrates and enzymes. In the case of long-lasting light treatment the time of light exposure seems to be more important than the high light dose.

Klíčová slova

lišejníky, pigmenty xyntofylového cyklu, glutation, antioxidaní enzymy, reaktivní formy kyslíku (ROS), DEPS, NPQ, lichens, pigments of xanthophyll cycle, glutathion, antioxidative enzymes, ROS, HPLC

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 4. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 24. 5. 2006
• Vedoucí: prof. Ing. Miloš Barták, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie