CE-LIF fúzního proteinu AHP5-GFP v komplexních vzorcích

Bc. Lenka Michalcová

Diplomová práce

CE-LIF of fusion protein AHP5-GFP in complex samples

Anotace:

V této práci se zabýváme proteinem AHP5 (Arabidopsis histidine phophotransfer protein 5) z cytokininové signální dráhy rostlin, který funguje jako přenašeč fosfátu mezi cytoplazmatickou membránou a buněčným jádrem. Fosforylace proteinu je lokalizována na histidinu, a díky nestabilitě fosfohistidinu v kyselém prostředí je nutné separaci i přípravu vzorku provádět za podmínek, kdy je fosfohistidin stabilní. Věnujeme se možnosti stanovení AHP5-GFP v komplexních vzorcích (bakteriální lyzáty, rostlinné extrakty a lyzáty) pomocí kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescencí (CE-LIF). Kontrolní metodou je metoda western blot, kde lze díky protilátkám proti zeleně fluoreskujícímu proteinu (GFP) sledovat úroveň exprese AHP5-GFP v jednotlivých organismech. Dále se tato práce zabývá možností neenzymatické fosforylace AHP5-GFP v částečně přečištěném vzorku. Za aplikace výše uvedených metodik na výše uvedené vzorky a standard GFP bylo zjištěno, že CE-LIF poskytuje dostatečnou citlivost pro AHP5-GFP a pro separaci fosforylované a nefosforylované formy AHP5-GFP však vyžaduje vhodnou a selektivnější purifikaci.

Abstract:

In this work, we study the protein AHP5 (Arabidopsis histidine phophotransfer protein 5) of cytokinin signaling pathway in plants. This protein acts as a phosphate transporter between cytoplasmic membrane and cell nucleus. Protein phosphorylation is located on histidine, which is instable in the acidic environment. Therefore, the sample preparation and separation has to be carried out under conditions in which fosfohistidine is stable. We have focused on the possibility of determination AHP5-GFP in complex samples (bacterial lysate, plant extract and lysate) using the capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection (CE-LIF). The control method is western blotting, where the anti-GFP antibodies enable monitoring the expression level of AHP5-GFP in individual organisms. This work also deals with the possibility of non-enzymatic phosphorylation of AHP5-GFP in a partially refined sample. The samples and green fluorescent protein (GFP) were analyzed by these methods. It was found that CE-LIF is sensitive enough for AHP5-GFP. Separation of phosphorylated and unphosphorylated AHP5-GFP requires suitable and selective purufication.

Klíčová slova

kapilární elektroforéza, CE-LIF, fosforylace proteinů, AHP5-GFP, komplexní vzorek, capillary electrophoresis, phosphorylation of proteins, GFP-AHP5, complex sample

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2012
• Vedoucí: prof. Mgr. Jan Preisler, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie