Porovnání metod izolací dvouvláknové RNA z rostlinného pletiva se zaměřením na výtěžnost virové frakce

Alena MATYÁŠOVÁ

Bachelor's thesis

Comparison of methods of isolating double-stranded RNA from plant tissue with a focus on viral fraction yield.

Abstract:

Pro diagnostiku rostlinných patogenů lze využít masivně paralelní sekvenování (HTS), které má výhodu v sekvenčně nespecifickém zachycení sekvencí všech přítomných organismů ve vzorku. Vstupní materiál lze připravit více metodami podle účelu použití. Cílem této práce je porovnat kvalitativní a kvantitativní profil dvou metod pro izolaci RNA z rostlinného pletiva s obohacením o dvouvláknové frakce za účelem zvýšení množství virových RNA vůči RNA hostitelské rostliny. Srovnávanými metodami jsou běžně využívaná afinní celulózní chromatografie a diferenciální centrifugace s LiCl. Jako výzkumný soubor byla použita rostlina jetele lučního (Trifolium pratense L.) infikovaná viry s jednovláknovými a dvouvláknovými RNA genomy. Tyto viry byly v rostlině v minulosti detekovány pomocí HTS. Testovanými metodami byly z rostliny extrahovány ribonukleové kyseliny. Pomocí metody RT-PCR byly amplifikovány specifické fragmenty osmi virů a po vyhodnocení gelové elektroforézy byl porovnán kvalitativní profil obou metod. Pro porovnání kvantitativního profilu byly vybrány tři viry s různými druhy RNA genomů. Metodou RT-qPCR byla provedena jejich relativní kvantifikace. S využitím softwaru Bio-rad CFX Manager 3.1 byla vyhodnocena normalizovaná exprese jednotlivých virů k 26S ribozomální RNA jako referenční kontrole. Pomocí obou porovnávaných metod byla detekována přítomnost všech testovaných virů. Po vyhodnocení kvantifikačních dat a provedení statistických testů (F-test, T-test) s hladinou významnosti = 0,05 bylo shledáno, že mezi metodou afinní celulózní chromatografie a metodou s diferenciální centrifugací s LiCl není signifikantní rozdíl.

Abstract:

High-throughput sequencing is one of methods used for diagnostics of plant pathogens and has advantage of unspecific unbiased detection of all nucleic acids present in a sample. Input material for HTS can be prepared using by different approaches that reflect purpose of the planned task. During viral infections of plants, viral double stranded RNAs are generated as replication intermediates or transcription products. Thus, they are often used for HTS. Nevertheless, such preparations contain large amount of plant RNAs. The work aimed for comparison of two methods of double stranded RNA enrichment - widely used cellulose chromatography and differential centrifugation with lithium chloride. Both qualitative and quantitative profiles of viral nucleic acids were estimated. An isolate HZ2 of red clover (Trifolium pratense L.) was used for the study. Previously, there were detected eight different RNA viruses with HTS-aimed analyses in the plant. To compare qualitative profile, RNA was extracted by each method, transcribed into cDNA, and specific viral fragments were amplified using PCR, followed by agarose gel electrophoresis. Quantitative profiles were analyzed using three selected viruses with single- and double-stranded RNA genomes. Their relative quantification was estimated using RT-qPCR approach. Further, normalized (to 26S rRNA as a reference) expressions were calculated using Bio-rad CFX Manager 3.1 software. All eight viruses were successfully detected using RNA material obtained by each method. After evaluating the quantification data and performing statistical tests (F-test, T-test; with a significance level of = 0.05), no significant difference was found between the compared methods.

Keywords

rostlinný virus, dsRNA, RNA extrakce, RT-PCR, RT-qPCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 8. 2019

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Igor Koloniuk, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Sciences

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Zdravotní laborant