Optimalizace mykoplazmového detekčního systému na bázi Rekombinázové polymerázové amplifikační reakce (RPA)

Bc. Veronika VAŇKOVÁ

Diplomová práce

Optimization of mycoplasma detection system based on Recombinase polymerase amplification (RPA)

Anotace:

Mykoplazmy jsou nejmenší prokaryotické buňky, které jsou schopny infikovat téměř všechny buněčné linie. Mykoplazmové infekce vedou k celé řadě změn v buněčných liniích a představují tak hlavní problém v technice buněčných kultur. K detekci rané fáze infekce, kdy je kontaminace mykoplazmy velmi nízká nebo za situace, kdy je potlačen růst mykoplazmy (ošetření buněčných kultur antibiotiky) je vyžadována vysoká citlivost detekčních metod. PCR patří mezi běžně používané molekulárně biologické metody k detekci mykoplazmové infekce buněčných kultur. Metoda PCR je poměrně nákladná a vyžaduje náročné přístrojové vybavení, a proto není vhodná pro analýzu v terénu. V poslední době dochází k rozvoji izotermálních amplifikačních technik, které mají oproti PCR řadu výhod. Jednou z těchto metod je Rekombinázová polymerázová reakce, RPA, která se díky vysoké specificitě a rychlosti používá k identifikaci nejrůznějších patogenů. Cílem teoretické části této diplomové práce bylo za použití uvedené literatury popsat charakteristiku mykoplazmy, shrnout vybrané metody detekce mykoplazmy v buněčných kulturách, popsat princip metody RPA, její výhody/nevýhody ve srovnání s metodou PCR a její použití. Cílem experimentální části diplomové práce byl vývoj a validace typizační soupravy TwistAmp? exo k detekci mykoplazmy pomocí RPA. Bylo zjištěno, že detekční limit metody RPA je stejný jako v případě metody real-time PCR, tj. 60 molekul syntetického standardu M. arginini na 1 ?l. Na základě výsledků této práce má metoda RPA vysoký potenciál k tomu, stát se alternativou metody real-time PCR k detekci mykoplazmové infekce v buněčných linií, i přes svoji odlišnou dynamiku. Pro získání CE-IVD značky bude potřeba provést ještě několik testů k dokončení validace této typizační soupravy.

Abstract:

Mycoplasmas are the smallest prokaryotic cells which are able to infect almost all of the cell lines. Mycoplasma infections lead to the various changes of cell lines and they represent the main issue in the cell culture techniques. For a detection of the early phase of infection when the contamination of mycoplasma is very low or in a situation when the growth of the mycoplasma is repressed (antibiotic treatment of cell cultures), the high-sensitivity detection methods are required. PCR is one of the commonly used molecular biology methods for a detection of mycoplasma infection of cell cultures. PCR method is relatively expensive and requires demanding instrument, therefore it is not suitable for a field analysis. Recently we can observe the development of the isothermal amplification technologies which have, in comparison with PCR, many benefits. One of these methods is a Recombinase polymerase reaction, RPA, which is used for an identification of various pathogens thanks to the high specificity and speed. The aim of the theoretical part of this diploma thesis was to describe the characteristics of mycoplasma, to summarize the selected methods of mycoplasma detection in cell cultures, to describe the principle of the RPA method, its advantages and disadvantages in comparison with PCR method and its application, using the listed literature. The aim of the experimental part of the diploma thesis was to develop and validate the typing kits TwistAmp? exo for a detection of mycoplasma using RPA. It was ascertained that a detection limit of RPA method is the same as real-time PCR method, i.e. 60 molecules of M. arginini synthetic standard per 1 ?l. Based on the results of this thesis, the RPA method has a huge potential to become an alternative to the real-time PCR method for a detection of mycoplasma infection in cell lines, despite the different dynamics. For the acquisition of the CE-IVD certification it will be necessary to execute a few more field test to complete the validation of these typing kits.

Klíčová slova

mykoplazma, buněčné kultury, kontaminace, optimalizace, RPA

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie