Sledování životaschopnosti Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis pomocí kultivačních a kultivačně nezávislých metod

Bc. Lucie Kubíčková

Master's thesis

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis viability determination using culture and culture independent methods

Abstract:

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) je původcem paratuberkulózy (Johneho choroba), která se vyskytuje nejčastěji u přežvýkavců, ale může vyvolat onemocnění i u jiných zvířat. Nemocná zvířata přenášejí onemocnění především trusem a kontaminovaným mlékem, přičemž nejvnímavější skupinou jsou mladí jedinci. Důležitá je proto včasná diagnostika, která se provádí nejčastěji z trusu, tkání, příp. mléka zvířat. Významnou součástí diagnostických metod je odstranění kontaminující mikroflóry vzorků pomocí dekontaminačních postupů, které však mohou způsobit snížení detekovatelných MAP ve vzorku. Při pomnožování MAP v tekutém médiu je rizikem kontaminace rychle rostoucími mikroorganismy z prostředí. Cílem této studie bylo určit životaschopnost různých MAP izolátů po třídenním a pětitýdenním ošetření kombinací antibiotik - vankomycinu, amfotericinu B a kyseliny nalidixové (VAN) pomocí metody kultivace na pevných médiích a kultivačně nezávislé PMA F57 real time PCR (qPCR) metody. Následně bylo sledováno potlačení růstu kontaminant při kultivaci trusu na pevných médiích po jedno až třídenní dekontaminaci 0,9% hexadecylpyridinium chloridem (HPC) a přídavkem VAN antibiotik v médiích. Během pětitýdenního ošetření antibiotiky došlo k úbytku živých MAP buněk, oproti ošetření třídennímu, kdy ke snížení MAP ve vzorku došlo pouze minimálně. Za koncentraci antibiotik, od které bylo možné pozorovat po pěti týdnech statisticky významné snížení životaschopnosti buněk, byla koncentrace 100 µg/ml v případě kultivační metody. V případě PMA F57 qPCR byl, po pětitýdenním ošetření, statisticky významný rozdíl v životaschopnosti MAP zaznamenán již při koncentraci 50 µg/ml. Jako nejméně životaschopný se ukázal laboratorní kmen 6381, naopak nejvíce živých MAP buněk bylo prokázáno v případě terénního izolátu 283/08. Kontaminující mikroflóra trusu byla úspěšně potlačena při působení všech kombinací koncentrací VAN antibiotik bez ohledu na délku dekontaminace.

Abstract:

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the causal agent of paratuberculosis (Johne's disease) afffecting mainly ruminants, but other animals can be infected as well. Infected animals transmit the disease mainly via faeces and contaminated milk whereas young animals belong to the most susceptible group. For this reason, early diagnosis performed mainly from faeces, tissues or milk play a significant role in disease transmission. Removal of contaminating microflora from biological samples using decontamination agents represents crucial part of the diagnostic methods although they can decrease number of detectable MAP cells in the sample. The aim of this study was to determine the viability of different MAP isolates after three-day and five-week treatment with antibiotics - vancomycin, amphotericin B and nalidixic acid (VAN) using cultivation and culture-independent PMA F57 real time PCR (qPCR) method. Subsequently, effect of one to three day decontamination using 0.9% hexadecylpyridinium chlorid (HPC) and VAN antibiotics in solid media to suppression of the contaminating microflora growth during cultivation of bovine faeces was studied. Five-week treatment wiht VAN antibiotic led to more distinct decrease in MAP viability compared to the three-day treatment. 100 mg/ml of antibiotics was the concentration, which statistically significantly reduced the viability of cells after five-week treatment as determined by culture. Using PMA F57 qPCR, 50 mg/ml was considered as a statistically significant after five-week treatment. Laboratory MAP strain 6381 showed the lowest ability to survive antibiotics treatment. Contaminating microflora from faeces was successfully suppressed in all combinations of VAN concentrations regardless the time of decontamination.

Keywords

Mycobaterium avium subsp. paratuberculosis, MAP, PMA, kultivace, PCR, HPC, antibiotika, cultivation antibiotics

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 13. 6. 2011
• Supervisor: Mgr. Radka Přibylová

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology