Monitoring komenzálních anaerobních bakterií v dutině ústní a střevě člověka

Bc. Renata Tomešová

Master's thesis

Monitoring of commensal anaerobic bacteria in the human oral cavity and intestine

Abstract:

V lidském gastrointestinálním traktu nalezneme velké množství mikroorganismů, které mají zásadní funkce při udržování zdraví člověka. Typickými zástupci jak v dutině ústní, tak ve střevě člověka, jsou komenzální bakterie z čeledi Bifidobacteriaceae. Za určitých podmínek však některé bakteriální taxony mohou být spojovány i s nežádoucími efekty. V této souvislosti jsou diskutovány bakterie rodu Fusobacterium, u nichž byla prokázána souvislost s řadou onemocnění. Cílem praktické části této diplomové práce bylo kultivační stanovení počtu bakterií z čeledi Bifidobacteriaceae a dalších bakteriálních komenzálů přítomných ve vzorcích slin a stolice dárců bez zjevných zdravotních obtíží (n = 30). Dále byla cílem izolace, následná identifikace detekovaných bakterií, jejich selekce, izolace DNA a následné uložení do sbírky Katedry mikrobiologie, výživy a dietetiky České zemědělské univerzity v Praze. U všech sledovaných skupin bakterií byly detekovány statisticky významně nižší počty ve slinách v porovnání se vzorky stolice. Průměrné celkové počty bakterií z čeledi Bifidobacteriaceae na selektivním médiu, s mupirocinem a kyselinou octovou, ve vzorcích slin dosahovaly hodnot 7,29 ± 0,55 log KTJ mL-1 a ve vzorcích stolice 8,92 ± 0,58 KTJ g-1. Na druhém selektivním médiu, obohaceném ještě o norfloxacin, byly detekovány jejich průměrné hodnoty 7,09 ± 0,73 KTJ mL-1 ve vzorcích slin a 8,95 ± 0,72 KTJ g-1 ve vzorcích stolice. Bakterie rodu Fusobacterium, které byly stanoveny na selektivním médiu s kyselinou nalidixovou a vancomycinem, dosahovaly průměrné hodnoty 8,14 ± 0,54 KTJ mL-1 ve vzorcích slin a 8,80 ± 0,77 KTJ g-1 ve vzorcích stolice. Ze všech selektivních médií bylo celkem odebráno 1080 bakteriálních izolátu, které byly dále morfologicky analyzovány a identifikovány za využití metody MALDI-TOF MS. Z cílených skupin komenzálních bakterií byly nejčastěji detekovanými bakteriálními rody v dutině ústní Prevotella, Alloscardovia, Schaalia, Bifidobacterium, Fusobacterium, Veillonella a Rothia, zatímco nejvíce zastoupenými rody ve střevě byly Bifidobacterium, Bacteroides a Phocaeicola. Na základě identifikace, jedinečnosti a morfologické variability bylo poté vyselektováno 174 izolátů ze vzorků slin a 187 izolátů ze vzorků stolice. Tyto izoláty byly uloženy do sbírky jako kontrolní skupina pro budoucí srovnání s onkologickými pacienty vedenými ve FN Královské Vinohrady v rámci vznikajícího výzkumného projektu. Součástí sbírky je také DNA uchovaných izolátů a celková DNA všech vzorků slin a stolice pro molekulárně-genetické analýzy.

Abstract:

In the human gastrointestinal tract, we find many microorganisms that have a fundamental function in maintaining human health. Typical representatives both in the oral cavity and in the human intestine are commensal bacteria from the Bifidobacteriaceae family. Under certain conditions, however, some bacterial taxa may also be associated with undesirable effects. In this context, bacteria of the genus Fusobacterium are discussed, which have been shown to be associated with several diseases. The aim of the practical part of this diploma thesis was the cultivation counts determination of bacteria from the Bifidobacteriaceae family and other bacterial commensals present in saliva and stool samples of donors without obvious health problems (n = 30). Furthermore, the goal was the isolation, subsequent identification of the detected bacteria, their selection, DNA isolation and subsequent storage in the strain collection of the Department of Microbiology, Nutrition and Dietetics of the Czech University of Life Sciences Prague. For all monitored groups of bacteria, statistically significantly lower numbers were detected in saliva compared to stool samples. The average total numbers of bacteria from the Bifidobacteriaceae family on selective medium, with mupirocin and acetic acid, in saliva samples reached values of 7.29 ± 0.55 log KTJ mL-1 and in stool samples 8.92 ± 0.58 KTJ g-1. On the second selective medium, enriched with norfloxacin, their average values were found to be 7.09 ± 0.73 KTJ mL-1 in saliva samples and 8.95 ± 0.72 KTJ g-1 in stool samples. Bacteria of the genus Fusobacterium, which were determined on a selective medium with nalidixic acid and vancomycin, reached an average value of 8.14 ± 0.54 KTJ mL-1 in saliva samples and 8.80 ± 0.77 KTJ g-1 in stool samples. A total of 1080 bacterial isolates were collected from all selective media, which were further morphologically analysed and identified using the MALDI-TOF MS method. Of the targeted groups of commensal bacteria, the most frequently detected bacterial genera in the oral cavity were Prevotella, Alloscardovia, Schaalia, Bifidobacterium, Fusobacterium, Veillonella and Rothia, while the most represented genera in the gut were Bifidobacterium, Bacteroides and Phocaeicola. Based on identification, uniqueness, and morphological variability, 174 isolates from saliva samples and 187 isolates from stool samples were then selected. These isolates were stored in the strain collection as a control group for future comparison with oncology patients treated at the Královské Vinohrady Medical Centre as part of an emerging research project. The resulting collection also includes the DNA of preserved isolates and the total DNA of all saliva and stool samples for molecular genetic analyses.

Keywords

kultivace, Bifidobacterium spp., Alloscardovia spp., Fusobacterium spp., mikrobiota

Keywords

microbiota, cultivation, Bifidobacterium spp., Alloscardovia spp., Fusobacterium spp.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 4. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 24. 5. 2024
• Supervisor: Ing. Nikol Modráčková, Ph.D.
• Reader: Gabriela Krausová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Food and Nutrition