Genomické profilování CD34+ buněk pacientů s CML

Bc. Michaela Potěšilová

Master's thesis

Genomic profiling in CD34+cells of CML patients

Abstract:

Chronická myeloidní leukémie (CML) je myeloproliferativní nádorové onemocnění, způsobené onkogenní aktivitou produktu genu BCR/ABL. Tato tyrosinkinasa aktivuje řadu molekulárních mechanismů, zapojených do nádorové transformce. Většina z nich však dosud není dostatečně prozkoumaná. Vhodným nástrojem ke studiu změn souvisejících s nádorovou transformací je technologie cDNA microarrays, která umožňuje sledovat genovou expresi na úrovní celého genomu. Vzhledem k předpokládanému vzniku CML již v hematopoetických kmenových buňkách jsme se rozhodli expresnímu profilování podrobit populaci CD34+ hematopoetických buněk z kostní dřeně. Za účelem provedení cDNA microarrays studie na CD34+ buňkách byla nejprve navržena a ověřena účinná metoda k izolaci a amplifikaci RNA z minimálního množství buněk. Ta byla následně aplikována na klinické vzorky a pomocí cDNA microarrays s 19 008 lidskými EST sekvencemi byly sestrojeny expresní profily klinických vzorků CD34+ hematopoetických buněk skupiny nově diagnostikovaných pacientů v chronické fázi CML, skupiny pacientů v kompletní cytogenetické remisi a zdravých dárců. Zároveň byly některé klinické vzorky rozděleny a zpracovány kromě CD34+ selekce také pomocí Lin- selekce, aby mohla být pomocí expresních profilů porovnána populace CD34+ a Lin- buněk. Bylo zjištěno, že populace CD34+ a Lin- buněk nejsou rovnocenné a že se odlišují v expresi 250 genů. Z povahy těchto genů jsme odvodili, že populace CD34+ je více obohacena o primitivní kmenové buňky, zatímco populace Lin- buněk se jeví jako více diferenciovaná. Skupina nově diagnostikovaných pacientů v chronické fázi CML vykazovala odlišnou expresi u 140 genů oproti zdravým dárcům. Mezi nimi se nacházely geny, které byly již ve spojitosti s CML popsány i některé nové geny, jejichž role v biologii onemocnění bude muset být teprve prostudována. Expresní profil pacientů v kompletní cytogenetické remisi se od zdravých dárců lišil v expresi pouhých 15 genů, což koresponduje s faktem, že většina buněk v kostní dřeni je v této fázi Ph-negativní, tedy neleukemická. V této práci jsme navrhli přesný metodický postup, jak přistupovat ke zpracování, hodnocení a analýze expresních profilů jednotlivých pacientů s CML.

Abstract:

Chronic myeloid leukemia is a myeloproliferative disorder caused by oncogenic activity of the Bcr/Abl protein. The Bcr/Abl tyrosinkinase activates many molecular mechanisms linked with malignant transformation. Unfortunately, most of these mechanisms are still unknown. The cDNA microarrays technology allows us to study gene expression at the level of whole genome. Therefore it can be used as a powerful tool for studying changes connected with malignant transformation. We decided to use CD34+ hematopoietic cells from bone marrow. It is supposed that leukemia originates in these cells. Therefore we used CD34+ cells for our expression profiling experiments. At first we selected and verified the method for RNA isolation and amplification to obtain sufficient amount of high-quality RNA for microarrays analysis. Than we used RNA from clinical samples to obtain expression profiles of the group of chronic phase CML patients, complete cytogenetic remission patients, and healthy volunteers. Some bone marrow samples were divided and the positive CD34+ selection and the negative Lin- selection were performed in order to compare these two populations of cells. We detected 250 genes which expression levels differed between CD34+ and Lin- cell population. After examination of these genes we found CD34+ population to be more like stem cells. Lin- population seemed to contain more differentiated cells than CD34+ population. Expression levels of 140 genes differed between the group of chronic phase CML patients and healthy volunteers. Some genes already known for being associated with CML were found as well as some new genes. Expression profiles of patients in complete cytogenetic remission differed from the ones of healthy individuals only in expression of 15 genes. It corresponds with the fact that majority of cells in bone marrow is Ph-negative in this phase and therefore non-leukemic. In this work we designed an accurate methodical procedure describing how to perform the analysis.

Keywords

Genomické profilování, cDNA microarrays, CD34+ buňky, chronická myeloidní leukémie Genomic profiling, CD34+ cells, chronic myeloid leukemia

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2008
• Supervisor: doc. RNDr. Irena Krontorád Koutná, Ph.D.
• Reader: Ing. Josef Jaroš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry