Úloha vybraných kináz v regulaci smrti nadorových buněk indukované chemoterapeutickymi látkami a cytokinem TRAIL

Mgr. Martin Krkoška, Ph.D.

Doctoral thesis

The role of selected kinases in regulation of cancer cell death induced by chemotherapeutic drugs and TRAIL cytokine

Abstract:

Chemoterapeutické látky na bázi platiny, jako je cisplatina (CDDP), jsou po desetiletí využívány k léčbě mnoha typů nádorových onemocnění. Interakce těchto sloučenin s intracelulárními strukturami, včetně vazby na DNA, způsobují buněčný stres související s poškozením DNA, narušují normální replikační a transkripční procesy a indukují buněčnou smrt/apoptózu nádorových buněk. Léčba látkami na bázi platiny je však často spojena s toxicitou pro nenádorovou tkáň a rezistencí nádorových buněk, což představuje závažné překážky protiná-dorové terapie. Molekulární mechanismy působení léčiv na bázi platiny, které se podílejí na usmrcování nádorových buněk, nejsou i přes jejich rozsáhlé využití stále plně objasněny. Kromě individuálního cytotoxického účinku mohou chemo-terapeutické látky na bázi platiny zvyšovat citlivost některých typů nádorových buněk vůči nádorově selektivním látkám jako je unikátní cytokin TRAIL (ligand indukující apoptózu, patřící do rodiny faktorů nekrotizujících nádory). V této práci bylo prokázáno, že látky na bázi platiny, jako je CDDP nebo LA-12, účinně zvyšují citlivost a významně posilují protinádorové účinky cytokinu TRAIL u lid-ských buněčných linií karcinomu prostaty (PC). Tyto účinky byly spojeny s akti-vací mitochondriální apoptotické dráhy závislé na funkci proteinů Bid/Bak. Nově jsme prokázali posílení cytotoxického působení kombinace LA-12 a cytokinu TRAIL u vzorků biopsií nádorů u pacientů trpících PC. Naše zjištění naznačující, že kombinace CDDP/LA-12 s cytokinem TRAIL přispívá k efektivnější eliminaci nádorových buněk prostaty, nás vedlo k podrobnému zkoumání souvisejících molekulárních mechanismů, včetně role vybraných specifických kináz zapoje-ných do regulace buněčné smrti. Checkpoint kináza 1 (Chk1) je považována za klíčovou v regulaci signál-ních drah ovlivňujících buněčný cyklus, reakci na poškození DNA, buněčnou smrt a představuje atraktivní cíl v moderní onkologii. Nízkomolekulární inhibitory Chk1 byly intenzivně zkoumány jednotlivě, nebo v kombinaci s různými chemo-terapeutickými látkami a bylo prokázáno, že významně zvyšují chemosenzitivitu mnoha typů nádorů. Detailní úloha Chk1 v modulaci protinádorového potenciálu léčiv na bázi platiny je však stále neobjasněna. V této práci bylo prokázáno, že SCH900776 (MK-8776), vysoce selektivní inhibitor Chk1 testovaný v klinických studiích fáze II, účinně zvyšuje citlivost lidských nádorových buněk tlustého stře-va k cytotoxickému působení CDDP/LA-12. Tyto účinky jsou závislé na protei-nech p53/p21, které zde ovlivňují typ a kinetiku buněčné odpovědi. V přítomnosti proteinů p53/21 vedlo kombinované působení těchto látek ke snížení hladin mitotických markerů, stimulaci úniku z mitózy a indukci apoptózy v G1/S fázi buněčného cyklu. V důsledku absence p53 došlo ke zpomalení apoptózy v G1/S fázi buněčného cyklu indukovanému kombinovaným působe-ním látek, zatímco absence p21 nebo PTEN buněčnou smrt urychlila. Tato zjiště-ní poskytla důležitý důkaz o úloze Chk1 v modulaci cytotoxického účinku CDDP/LA-12 a zdůraznila potenciál klinického kandidáta SCH900776 pro použití v kombinaci s těmito látkami jako možnou protinádorovou strategii u solidních nádorů. Naše současná zjištění dále odhalila dosud neobjasněný potenciál SCH900776 posílit cytotoxický účinek kombinace platinových látek s cytokinem TRAIL u lidských nádorových buněk prostaty. Působení trojkombinace SCH900776, cisplatiny a cytokinu TRAIL je spojeno se stimulací mitochondriální apoptotické dráhy závislé na proteinu Bak, s aktivací kaspáz a zvýšeným poško-zení DNA. Také jsme prokázali, že cytotoxická odpověď

Abstract:

vyvolaná kombinací SCH900776, CDDP a cytokinu TRAIL může být dále ovlivněna změnami množství proteinu Mcl-1. Tyto výsledky by mohly být užitečné pro navrhování kombino-vaných léčebných přístupů založených na současné modulaci hladin/aktivity Chk1 a Mcl-1, protože obě tyto molekuly jsou klíčové pro kontrolu buněčné smr-ti a poškození DNA, zvláště u nádorových buněk prostaty, kde jsou často deregu-lovány. Závěrem lze shrnout, že získané výsledky odhalují nové molekulární me-chanismy zodpovědné za efektivnější usmrcení nádorových buněk prostaty in-dukované kombinací CDDP/LA-12 s cytokinem TRAIL a zároveň objasňují zapo-jení Chk1 kinázy v cytotoxicitě zprostředkované těmito látkami. Naše výsledky zdůrazňují důležitost cílení na Chk1 jako účinnou strategii k překonání rezistence u nádorových buněk prostaty, což by mohlo být užitečné pro navrhování bu-doucích léčebných strategií.

Abstract:

Platinum-based chemotherapeutic drugs like cisplatin (CDDP) have been used for decades in the clinic in treatment of various cancer types. These compounds bind to numerous intracellular targets including DNA, cause stress related to the DNA damage, disrupt normal replicative and transcriptional processes, and induce cancer cell death/apoptosis. The platinum drug-based treatment is also frequently associated with toxicity for non-malignant tissues and cancer cell resistance, repre-senting crucial obstacles in anticancer therapy. Despite their frequent use, exact molecular mechanisms involved in killing action of platinum-based drugs are still incompletely understood. In addition to their individual cytotoxic action, platinum-based chemotherapeutic drugs have been suggested as effective sensitizers of several cancer cell types to tumor-selective anticancer agents such as TRAIL (tu-mor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), a unique cytokine from the TNF family. We newly demonstrated that pretreatment with platinum-based drugs CDDP or LA-12 significantly enhanced killing effects of TRAIL in human prostate cancer (PC) cells. These effects were associated with the activation of Bid/Bak-dependent mitochondrial apoptotic pathway. We also provided the first evidence of the enhanced cytotoxic action of the combination of LA-12 and TRAIL in human patient-derived primary PC biopsies. Our findings indicating that the combination of CDDP/LA-12 and TRAIL contributes to more effective PC cell elimination prompted us to detailed investigation of related molecular mechanisms, including the role of selected specific kinases involved in regulation of cell death/survival. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is widely considered to be a key to the regulation of signaling pathways affecting the cell cycle, DNA damage response (DDR), and the cell death, and represents an attractive target in modern oncology. Small-molecule inhibitors of Chk1 have been intensively investigated as single agents or in combi-nation with various chemotherapeutic drugs and have been shown to significantly enhance the chemosensitivity of numerous tumor types. However, the role of Chk1 in modulating the anticancer potential of platinum-based drugs has been uncertain. Here we demonstrated the ability of SCH900776 (MK-8776), a highly selective Chk1 inhibitor profiled in phase II clinical trials, to effectively sensitize human colon cancer cells to the cytotoxic action of CDDP or LA-12, and showed that p53/p21 status affects the preferential type and kinetics of the cell response. Treatment of p53/21 wild-type colon cancer cells with the combination of the platinum-based drugs and SCH900776 resulted in a significant decrease in the level of mitotic markers, stimulation of mitotic slippage, and apoptosis related to G1/S phase of the cell cycle. The absence of p53 significantly delayed but not abolished G1/S phase-related drug combination-induced apoptosis, while p21 or PTEN deficiency accel-erated cell death. These findings provided important evidence on the role of Chk1 in the modulation of the cytotoxic action of CDDP/LA-12, suggested the mecha-nisms involved, and highlighted the potential of the clinical candidate SCH900776 to be used in combination with these drugs as possible anticancer strategy in solid tumors. Our recent findings further showed so far unknown potential of SCH900776 to enhance the cytotoxic action of the combination of platinum-based drugs and TRAIL in human PC cells. The action of SCH900776, CDDP and TRAIL triple drug combination has been associated with the stimulation of the Bak– and caspase-dependent mitochondrial apoptotic pathway and increased DNA damage. Further-more, we demonstrated that the cytotoxic response induced by the combination of SCH900776, CDDP and TRAIL can be further affected by manipulations of cellular Mcl-1 level. These findings might be useful for designing combination treatments based on simultaneous modulation of levels/ac

Abstract:

tivity of Chk1 and Mcl-1, as both these molecules are essential for the control of cell death and DNA damage and are often deregulated in PC. Taken together, these original results uncovered novel molecular mecha-nisms responsible for the enhancement of PC cell death induced by the combina-tion of CDDP/LA-12 and TRAIL and clarified the involvement of Chk1 in the drug-mediated cytotoxicity. Our results highlight the importance of targeting Chk1 as an efficient strategy to overcome resistance in human PC cells, which might be useful for designing the future strategies in PC treatment.

Keywords

Chk1, cisplatin, LA-12, TRAIL, apoptosis, cell death, DNA damage, prostate cancer Chk1, cisplatina, apoptóza, buněčná smrt, poškození DNA, nádorové onemocnění prostaty

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 1. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 3. 3. 2023
• Supervisor: doc. RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D.
• Reader: Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc., Dr. Alexander Pintzas

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology