Mikroorganismy štěpící celulózu a jejich aktivita v bachoru jelena evropského

Ing. Jiří Šimůnek

Doctoral thesis

Celullolytic microorganisms and their activity in the rumen of red deer

Abstract:

AbstraktMikrobiální komunita domácích přežvýkavců v bachoru je jedním z nejlépe charakterizovaných systémů schopných účinného rozkladu biomasy. Současná studie je zaměřena na mikrobiální ekologii v bachoru nedomestikovaných zvířat. Dosud byly prezentovány jen některé studie mikrobiální ekologie volně žijících přežvýkavců. V této konkrétní studii jsme rozšířili znalosti z oblasti mikrobiální ekologie volně žijících přežvýkavců prostřednictvím analýzy mikrobiomu v bachoru jelena evropského (Cervus elaphus) v České republice v konfrontaci s domácími přežvýkavci.Pro definici rozmanitosti a složení mikrobiálních komunit v obsahu bachoru byly použity molekulárně genetické metody, DGGE, qPCR, NGS. Kultivačními technikami byly izolovány kmeny bakterií s celulolytickou aktivitou. U vybraného izolátu byla provedena základní enzymologická analýza celulas a použity některé proteomické techniky. Vzorky k analýzám byly odebrány z bachoru jelena evropského (Cervus elaphus), daňka skrnitého (Dama dama), ovce domácí (Ovis aries) a tura domácího (Bos primigerius). Ekologické a statistické analýzy výsledků ukázaly rozmanitost v porovnání jednotlivých bakteriálních a houbových komunit v analyzovaných vzorcích. Ve všech vzorcích dominovaly kmeny Firmicutes a Bacteriodetes, u hub dominoval rod Orpinomyces. Relativní množství jednotlivých bakterií se liší jak mezi jednotlivými zvířaty jednoho druhu, tak i v rámci druhů. Rozmanitost mezi jednotlivými vzorky byla potvrzena i analýzou gelu DGGE pomocí softwaru Bionumerics v. 7.2.1., kterým byly detekovány jednotlivé bandy vzorků, na základě čehož byla provedena PCoA analýza a sestrojen dendrogram (dendrogam) pomocí UPGMA with Pearsons correlation. Dále byla provedena studie zastoupení hlavních představitelů celulolytických bakterií Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus a Ruminococcus flavefaciens u jednotlivých zvířat. Bylo prokázáno, že počty jednotivých druhů bakterií se liší mezi jednotlivými druhy zvířat i populací. Dále bylo izolováno 47 čistých bakteriálních kultur s celulolytickou aktivitou. Vybraný kmen C10 Actinomyces sp..,byl podroben genotypové, fenotypové a protemické analýze. Kmen C10 je podobný s Actinomyces glycerinitolerans a Actinomyces succinicruminis. Byly popsány vlastnosti celulas kmene C10 a výsledky byly publikovány. Výsledky této studie ukazují, že bakteriální rozmanitost v bachoru divokých i domácích přežvýkavců je značná z pohledu počtů jednotlivých druhů bakterií a hub mezi přežvýkavci. Struktura jednotlivých druhů mikroorganismů je podobná. Z našich zjištění vyplývá, že bachorové mikrobiomy volně žijících přežvýkavců jsou aktivnější a efektivnější v degradaci rostlinných substrátů.Tato studie ukazuje, že mikrobiální rozmanitost v bachorem volně žijících přežvýkavců vykazuje značnou podobnost s mikrobiomem v bachorem domácích přežvýkavců. Dřívější studie zaměřené na domácí přežvýkavce však nebyly reprezentativní pro mikrobiální rozmanitost v bachorech divokých přežvýkavců, a proto by studie mikrobiální diversity u volně žijících přežvýkavců měly pokračovat a měly by být rozšířeny formou izolací a charakterizací nových druhů bakterií a jejich enzymů zaměřených na degradaci celulosy.

Abstract:

The rumen microbial community of ruminants is one of the well-characterized systems capable of effectively decomposing biomass. The present is focused on microbial ecology in rumen of non-domesticated animals. Only some studies of the microbial ecology of wild ruminants have been presented so far. In this particular study, we have extended our knowledge in field of the microbial ecology of wild ruminants by analyzing the bacterial populations in rumens of Cervidae animals in the Czech in comparison with domestic ruminants.Molecular genetic approach (DGGE, qPCR, NGS) was used to define the diversity and composition of microbial communities in rumen content. Cultivation techniques were used for isolation of bacterial strains with cellulolytic activity. The selected isolates were subjected to basic enzyme analysis of cellulose activities and some proteomic techniques were used. Samples for analysis were taken from the European Deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), domestic sheep (Ovis aries) and domestic tour (Bos primigerius). Ecological and statistical analysis of the results showed the high level of microbial diversity in comparison of the individual bacterial and fungal communities in the analyzed samples. Firmicutes and Bacteriodetes were found to be dominant in all specimens, the most numerous genus of fungi was Orpinomyces spp. The relative amount of individual bacteria varies between animals of one species and among species. The diversity between samples was confirmed by DGGE gel analysis using the Bionumerics v. 7.2.1 software, which detected individual sample bands, based on PCoA analysis and a dendrogram using UPGMA with Pearsons correlation. The Next Generation method of sequencing (NGS) was used to define diversity and composition of microbial communities in rumen content. This method is based on principle of hypervariable areas focus VS-V3 16S rDNA: 11 samples of red deer (Cervus elaphus), 2 samples of roe deer (Capreolus capreolus), 1 sample of fallow deer (Dama dama) and 1 sample of the sheep (Ovis aries). Ecological and statistical analysis of results obtained from QIIME software showed considerable diversity in analysed samples when particular bacterial communities compared. In all samples Firmicutes and Bacteriodetes phyla were dominant. Furthermore, a study of the most important representatives of cellulolytic bacteria (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus and Ruminococcus flavefaciens) were carried out in individual animals. It has been shown that the number of single species of bacteria varies between animal species and populations. In all ruminants the same dominant bacteria phyla Bacteriodetes and Firmicutes were found. They differed in relative numbers of detected sequences. Statistically significant differences in particular sequences frequency were proven for uncultured Bacteriodales bacteria order, Clostridiales, for uncultured Ruminococcaceae bacteria family, for Prevotela and Selemonas orders in samples obtained from roe deers. Furthermore, statistically significant differences were also found for uncultured Lachnospiraceae bacteria family in sheep and Ruminococcus bacteria species in red deers. This study suggests that diversity of bacterial community in rumen of wild ruminants shows considerable similarity to those bacterial populations in rumen of domesticated ruminants. Furthermore, 47 pure bacterial cultures with cellulolytic activity were isolated. The selected strain of C10 Actinomyces sp., was subjected to genotypic, phenotypic and proteomic analysis. Strain C10 is similar to Actinomyces glycerinitolerans and Actinomyces succinicruminis. The cellulosic properties of C10 strain were described and the results were published.The results of this study show that bacterial diversity in the rumen of wild and domestic ruminants is considerable in terms of the numbers of species of bacteria and fungi among ruminants. The structure of individual species of microorganisms is similar.

Abstract:

Our findings suggest that rumen microbiomes of wild ruminants are more active and more effective in degradation of plant substrates. However, previous studies were not representative of microbial diversity in wild ruminant rumen, therefore studies of microbial diversity in wild ruminants should continue and should be expanded by means of isolation and characterization of new bacterial species and their enzymes aimed at degradation of cellulose.

Keywords

bachor, přežvýkavci, diverzita, celulolytické bakterie, enzymy

Keywords

herbivores, diversity, celulolytic bacteria, enzymes, rumen

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 9. 2017

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Eva Vlková, Ph.D.
• Reader: Václav Kudrna, Ing., externi, Peter Pristaš, externi, Ingrid Koppová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Animal Science / General Animal Science