Identifikace patologických procesů spojených s cévním zánětem a možnosti jejich léčby

Mgr. Adolf Koudelka, Ph.D.

Doctoral thesis

Identification and possible treatment of pathological processes associated with vascular inflammation

Abstract:

Existuje obrovské množství důkazů, že cévní zánět hraje rozhodující roli v rozvoji kardiovaskulárních onemocnění. Tato pozitivní zpětná vazba mezi pro-zánětlivými imunitními buňkami a buňkami cévní stěny vede až k rozvoji patologických stavů, jako plicní hypertenze (PH) a ateroskleróza, jejichž důsledkem je zvýšení rizika srdečního selhání nebo cévní mozkové příhody. Jedním z prediktorů mortality u pacientů trpících PH je zvýšená hladina asymetrického dimethylargininu (ADMA) v krvi. ADMA je endogenním inhibitorem endoteliální syntázy oxidu dusnatého (eNOS) a právě inhibice produkce oxidu dusnatého (NO) dělá z ADMA jeden z klíčových mediátorů nerovnováhy v hladinách pro-a proti-zánětlivých mediátorů. Tato nerovnováha následně vede až k rozvoji PH. Prvním cílem této práce tedy bylo zhodnotit, zda má ADMA vliv i na jiné signální dráhy zapojené v rozvoji PH, a to na dvou modelech: plicních cévních endoteliálních a hladkosvalových buňkách a také porovnat ADMA-indukovanou plicní vaskulární dysfunkci se zavedeným modelem hypoxií-indukované dysfunkce. Data prezentovaná v této práci ukázala že ADMA, stejně tak jako hypoxie, indukoval aktivaci signálního transduktoru a aktivátoru transkripce 3 (STAT 3) a stabilizaci hypoxií-indukovatelného faktoru 1 alfa (HIF-lα) v endoteliálních i hladkosvalových buňkách. Aktivace dráhy STAT 3/HIF-1α vedla ke snížení produkce NO prostřednictvím inhibice eNOS, také k aktivaci produkce pro-zánětlivých a adhezních proteinů v endoteliálních buňkách, a ke zvýšené intracelulární koncentrace Ca2+/proliferaci hladkosvalových buněk. Tyto procesy jsou spojeny s masivní přestavbou cévní stěny a rozvojem PH, kvůli čemuž představují vážnou zdravotní komplikaci. Vzhledem k tomu, že zatím nejsou známy žádné účinné strategie pro léčbu PH, mým cílem bylo zkoumat vliv proti-zánětlivé nitro-olejové kyseliny (NO2-OA) na STAT 3/HIF-1α signální dráhu v plicních cévních endoteliálních buňkách. NO2-OA je endogenně produkovaná pod vlivem zánětlivých nebo metabolických dějů a vykazuje pleiotropní imuno-regulační potenciál, který může představovat novou možnost léčby chronických zánětlivých onemocnění. NO2-OA byla schopna snížit aktivaci STAT 3/HIF-1α u obou modelů zánětu plicních endoteliálních buněk vyvolaného ADMA či hypoxií. Tyto změny vedly k inhibici ADMA- a hypoxií-vyvolaných změn v produkci NO, expresi eNOS a produkci pro-zánětlivých cytokinů a adhezních molekul. Jednou z nejzávažnějších komplikací a spouštěčů PH je plicní fibróza, která zahrnuje proces endoteliálně-mezenchymální tranzice (EndMT). Během EndMT mění endotelové buňky, vlivem zánětlivých mediátorů produkovaných imunitními buňkami (cytokiny a transformující růstový faktor beta, TGF-β), svůj fenotyp na myofibroblasty/fibroblasty a migrují stěnou cévy, což vede ke ztrátě její správné funkce. V následných pokusech byl na modelech myších a lidských endoteliálních buňkek zkoumán vliv NO2-OA na cytokiny- a TGF-β-vyvolanou aktivaci signálních drah STAT 1/3, mitogenem aktivovaných protein kináz (MAPK), jaderného faktoru kappa B (NFκB) a Smad 2/3, a byly sledovány následné změny ve funkci buněk. NO2-OA inhibovala aktivaci všech zmíněných signálních drah v obou buněčných liniích a inhibovala rozvoj pro-fibrotického fenotypu endoteliálních buněk. Tato dizertační práce prezentuje nové signální dráhy zapojené do procesu rozvoje cévního zánětu, a stejně tak novou strategii léčby cévní patogeneze spojené se zánětem.

Abstract:

There is tremendous amount of evidence that vascular inflammation plays a critical role in the development of cardiovascular diseases. This positive feedback loop between pro-inflammatory immune cells and vascular wall cells lead to the development of pathologies, such as pulmonary hypertension (PH) and atherosclerosis, resulting in increased risk of heart failure or stroke. One of the predictors of mortality of PH patients is increased blood level of asymmetric dimethylarginine (ADMA), an endogenous inhibitor of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Inhibition of nitric oxide (NO) production makes ADMA one of the key mediators of imbalance in pro- and anti-inflammatory mediators, that leads to the development of PH. The first objective of this thesis was to evaluate influence of ADMA on other signaling pathways during PH development in two models: pulmonary arterial endothelial and smooth muscle cells, and also compare ADMA-induced pulmonary vascular dysfunction with well established model of hypoxia-induced dysfunction. Data presented in this thesis showed that ADMA, such as hypoxia, induced the activation of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT 3) and stabilization of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α) in endothelial cells as well as in smooth muscle cells. Activation of STAT 3/HIF-1α pathway led to reduction of NO production via eNOS inhibition, and activation of pro-inflammatory and adhesion proteins production in endothelial cells as well as increased intracellular Ca2+/proliferation of smooth muscle cells. These processes are associated with massive vessel wall remodeling, and PH development and represents serious health complication. Since the treatment strategies of PH remain largely unknown, my work was focused on examining the influence of anti-inflammatory agents nitro-oleic acid (NO2-OA) to STAT 3/HIF-1α signaling pathway in pulmonary endothelial cells. NO2-OA is endogenous product of inflammatory or metabolic reactions and exhibits pleiotropic immuno-regulatory potential, which may represent a novel therapeutic strategy for inflammatory diseases. NO2-OA was able to mitigate STAT 3/HIF-1α signaling pathway in both models of ADMA- and hypoxia-induced pulmonary endothelial inflammation. These changes led to alleviation of ADMA- and hypoxia-induced changes in NO production, eNOS expression, and pro-inflammatory cytokines and adhesion molecules production. One of the most serious complications and triggers of PH is pulmonary fibrosis, which includes process of endothelial-mesenchymal transition (EndMT). During EndMT, by the influence of inflammatory immune cells-derived mediators (cytokines and transforming growth factor beta, TGF-β), endothelial cells changes its phenotype to myofibroblasts/fibroblasts and migrates through vessel wall, which leads to loss of vessel wall function. In this model was investigated influence of NO2-OA to cytokine- or TGF-β-mediated activation of STAT 1/3, mitogen-activated protein kinases (MAPKs), nuclear factor kappa B (NFκB) and Smad 2/3 in murine and human endothelial cells, and monitored subsequent changes in cellular functions. NO2-OA mitigated activation of all signaling pathways in both cell lines and inhibits development of pro-fibrotic phenotype of endothelial cells. This Ph.D. thesis presents new signaling pathways involved in vascular inflammatory processes, as well as new strategy for treatment of vascular inflammatory pathogenesis.

Keywords

nitro-fatty acid, NO2-FA, nitro-oleic acid, NO2-OA, nitric oxide, NO, asymmetric dimethylarginine, ADMA, vascular inflammation, signal transducer and activator of transcription, STAT, nitrovaná mastná kyselina, kyselina nitroolejová, oxid dusnatý, asymetrický dimethylarginin, přenašeč signálu a aktivátor transkripce, cévní zánět

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 8. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 10. 9. 2018
• Supervisor: Mgr. Michaela Pekarová, Ph.D.
• Reader: Juan Santibanez, Ph.D., prof. Ing. Jan Vacek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology