Analýza genetických rozdílů mezi jednohostitelskými a dvouhostitelskými zástupci Leishamaniinae za účelem identifikace nových virulentních faktorů

Ing. Natalia KRAEVA

Doctoral thesis

Analysis of genetic differences between monoxenous and dixenous Leishmaniinae for identification of novel virulence factors

Abstract:

Leishmania is a dixenous (two hosts) parasite that infects vertebrates, including humans, and transmitted by a sand fly. This parasite causes leishmaniasis, a disease threatening millions of people around the world. No vaccines are available, drugs are toxic and expensive, and parasites develop resistance to chemotherapy. The life cycle of monoxenous (one host) Leptomonas species is confined to an insect host. These single host parasites together with Leishmania are a part of the subfamily Leishmaniinae. Recently published data confirmed the hypothesis that dixenous flagellates have originated from insect parasites. In support of the above, the co-infection cases involving dixenous Leishmania spp. and monoxenous species in immunocompromised individuals were documented. The main opportunistic parasite has been identified as Leptomonas seymouri. Exploring new niches in mammalian host must be accompanied by acquisitions of the genes/pathways providing the adaptation to warm-blood environment and ability to evade the human immune system. The studies of the monoxenous parasites promise to be instrumental for both understanding the origin of the Leishmania dixenous life cycle and identification the novel potential drug targets. In my thesis, I present 6 publications I co-authored that share the same common idea - to shed more light on Leishmania pathogenicity. In the first two publications we provided high-quality annotated genomes for two monoxenous parasites - Leptomonas pyrrhocoris and L. seymouri from the subfamily Leishmaniinae. Using the sequenced genomes and differential expression data, we pinpointed genes gained in Leishmania and identified several additional proteins potentially involved in virulence. We demonstrated that L. seymouri is well adapted for the environment of the warm-blooded host. The whole transcriptome profiles of this species, cultivated at low and high temperatures, helped us to identify genes and pathways differentially expressed under these experimental conditions. Moreover, L. seymouri was found to persist for several days in Phlebotomus spp. (a vector implicated in L. donovani transmission). However, it was not capable to infect vertebrate cells under normal conditions. The next two publications describe an establishment of the conditional T7 polymerase-driven Tetracycline-inducible protein expression system in Leishmania mexicana for functional gene analysis. In the fifth publication we showed that the catalase gene, selected for further investigations in the first two manuscripts, was secondarily lost from the genomes of all Leishmania species sequenced so far. This loss seems to be a necessary prerequisite for adaptation to dixeny. Finally, in the last publication we found that another selected gene (LmxM.30.2090), encoding L. mexicana ALD1 (ATP/GTP binding motif-containing protein related to Leishmania development 1) protein with no assigned functional domains or motifs, plays a role in Leishmania infection and colonization in vitro and in vivo.

Abstract:

Leishmania je dixenní (dvouhostitelský) parazit, který infikuje obratlovce, včetně člověka, a je přenášen koutulemi. Tento parazit způsobuje leishmaniózu, nemoc ohrožující milióny lidí na světě. Vakcíny nejsou k dispozici a léky jsou toxické a nákladné, a paraziti si vytvářejí rezistenci na chemoterapii. Životní cyklus monoxenních (jednohostitelských) druhů Leptomonas je omezen pouze na hmyzí hostitele. Tito jednohostitelští parazité spolu s leishmániemi jsou součástí čeledi Leishmaniinae. Nedávno publikovaná data potvrdila hypotézu, že dvouhostitelští bičíkovci vznikli z parazitů hmyzu. Výše uvedené je podpořeno zjištěním, že byly u imuno-suprimovaných jedinců dokumentovány případy ko-infekce, zahrnující dvouhostitelské druhy leishmánií a jednohostitelské druhy. Hlavním oportunistickým parazitem byl identifikován druh Leptomonas seymouri. Hledání nových nik u savčích hostitelů musí být doprovázeno získáním genů/drah, které poskytují adaptaci pro teplokrevné prostředí a schopnost uniknout lidskému imunitnímu systému. Studium jednohostitelských parazitů slibuje být nápomocné jak pro porozumění vzniku dvouhostitelského životního cyklu leishmánií, tak pro identifikaci nových potenciálních cílů pro léky. Ve své práci představuji 5 publikací, kde jsem spoluautorkou, a které sdílejí společnou myšlenku - osvětlit patogenitu leishmánií. V prvních dvou publikacích jsme poskytli vysoce kvalitní anotované genomy pro dva monoxenní parazity - Leptomonas pyrrhocoris a L. seymouri z podčeledi Leishmaniinae. S použitím sekvenovaných genomů a dat o diferenciální expresi jsme určili geny získané v leishmániích a identifikovali několik dalších proteinů potenciálně způsobujících virulenci. Demonstrovali jsme, že L. seymouri je dobře adaptovaná na prostředí teplokrevného hostitele. Celo-transkriptomové profily tohoto druhu, kultivované při nízkých a vysokých teplotách, nám pomohly identifikovat geny a dráhy diferenciálně exprimované za těchto experimentálních podmínek. Navíc, L. seymouri může přetrvávat v druzích rodu Phlebotomus (vektor zapojený do přenosu L. donovani) po několik dní. Nicméně tento druh nebyl schopný infikovat buňky obratlovců za normálních podmínek. Další dvě publikace popisují zavedení podmínečného proteinového expresního systému spouštěného T7 polymerázou a indukovatelného tetracyklinem v Leishmania mexicana za účelem genové funkční analýzu a demonstrují limitace jeho použití. V páté publikaci jsme ukázali, že gen pro katalázu, vybraný pro další zkoumání v předchozích dvou publikacích, byl sekundárně ztracen dosud ze všech genomů leishmánií. Tyto ztráty se zdají být nutným předpokladem pro adaptaci pro dixenii. Na závěr, v poslední publikaci jsme zjistili, že další vybraný gen (LmxM.30.2090), kódující protein ALD1 u L. mexicana, který nemá přiřazené žádné funkční domény nebo motivy, hraje roli při infekci leishmániemi a při kolonizaci in vitro a in vivo.

Keywords

Leishmania, virulence, ko-infekce, systém indukovatelný tetracyklinem, kataláza

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 7. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 24. 8. 2017
• Supervisor: Vyacheslav Yurchenko, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Biology