Vybrané biofyzikální metody jako nástroje pro studium inhibitorů lidského cyklofilinu D

Jan Hurdálek

Bakalářská práce

Selected biophysical methods as tools for the study of human cyclophilin D inhibitors

Anotace:

Cyklofiliny, patřící do skupiny enzymů s peptidyl-prolyl cis-trans isomerasovou aktivitou, jsou často považovány za slibnou neznámou v našem porozumění lidskému zdraví. Cyklofilin D hraje významnou roli v patofyziologii Alzheimerovy choroby a také dalších vážných onemocněních, především kvůli svému zapojení ve vzniku mitochondriálního póru přechodné propustnosti. Několik studií ukazuje, že snížení aktivity cyklofilinu D může zlepšit kvalitu i prodloužit délku lidského života, přesto vývoj selektivních, bezpečných a účinných inhibitorů cyklofilinu D zaostává. Cílem této bakalářské práce bylo purifikovat lidský cyklofilin D z pelet E. coli geneticky modifikovaných pro jeho expresi a použít dvě vybrané biofyzikální metody, diferenciální skenovací fluorimetrii a izotermální titrační kalorimetrii, k rozpoznání a popsání interakcí několika nových testovaných látek a několika známých inhibitorů cyklofilinu D s tímto enzymem. Pro určení selektivity testovaných látek k cyklofilinu D byly prováděny stejné testy také na purifikovaném cyklofilinu A. Purifikace byla úspěšná a vynesla čistý a koncentrovaný roztok pro cyklofilin D i cyklofilin A, což bylo dokázáno pomocí elektroforézy a Western blotu. Diferenční skenovací fluorimetrie byla pečlivě optimalizována a nakonec přinesla uspokojivé výsledky v podobě vytipování několika testovaných látek pro hlubší studium interakce izotermální titrační kalorimetrii.

Abstract:

Cyclophilins, part of the family of enzymes with peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity, are commonly considered as a promising unknown in our understanding of human health. Cyclophilin D plays significant role in pathophysiology of Alzheimer’s disease as well as other severe pathological states, mainly due to its involvement in mitochondrial permeability transition pore genesis. Several studies show that reduction of cyclophilin D activity may result in improving both quality and length of human life, yet development of selective, safe and efficient cyclophilin D inhibitors still lags behind. The objective of this bachelor thesis was to purify human cyclophilin D from pellet of E. coli genetically modified to express this protein and to use two chosen biophysical methods, differential scanning fluorimetry and isothermal titration calorimetry, to discover and describe interactions of few novel tested compounds as well as few known cyclophilin D inhibitors with this enzyme. Selectivity of the tested compounds to cyclophilin D was determined by the same assays with purified cyclophilin A. Purification was successful yielding pure, highly concentrated stocks for both cyclophilin D and cyclophilin A, which had been proved by electrophoresis and the Western blot. Differential scanning fluorimetry was finely optimised and provided satisfying results that helped select several tested compounds for deeper study of interaction by isothermal titration calorimetry.

Klíčová slova

Cyklofilin D, inhibitory cyklofilinu D, cyklofilin A, metody biofyzikální, diferenciální skenovací fluorimetrie, izotermální titrační kalorimetrie

Keywords

Cyclophilin D, cyclophilin D inhibitors, cyclophilin A, methods biophysical, differential scanning fluorimetry, isothermal titration calorimetry

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 7. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 25. 8. 2021
• Vedoucí: doc. RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D.
• Oponent: PharmDr. Ondřej Benek, Ph.D.

Univerzita Hradec Králové

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Chemie / Toxikologie a analýza škodlivin