Studium proteinových komplexů zajišťujících stabilitu rostlinného genomu

Ing. Lucie Najdekrová, Ph.D.

Disertační práce

Study of protein complexes ensuring the stability of the plant genome

Anotace:

Stabilita genomu, jež je nezbytná pro správné fungování buněk, je zabezpečována především efektivními opravnými mechanismy. Jako velmi škodlivý druh poškození, dvojřetězcové zlomy, mohou vystupovat i konce lineárních chromozomů, pokud nejsou dostatečně chráněny. Telomery, nukleoproteinové komplexy, které odlišují přirozené konce chromozomů od zlomů DNA, se tak spolu s enzymem telomerázou, jež je udržuje, také podílejí na zachování integrity genomu. Mezi komplexy účastnící se ochrany telomer nepatří jen specifické telomerově-vazebné proteiny, ale paradoxně také mnohé reparační proteiny, které zabraňují nežádoucím rekombinacím a chromozomálním fúzím. Praktická část předkládané dizertační práce se v první části věnuje studiu funkce jedné z podjednotek opravného komplexu MRN, proteinu Nbs1, zejména ve vztahu k stabilitě telomer Arabidopsis thaliana (Najdekrova a Siroky, 2011). Zatímco u jednoduchých nbs1 mutantů jsme nenalezli žádné vývojové nebo chromozomální defekty, u dvojitých nbs1-tert mutantů, kteří kromě Nbs1 postrádají i funkční enzym telomerázu, se velmi progresivně, během tří generací objevily závažné abnormality. Nejen morfologicky patrné vývojové defekty, ale také výrazné chromozomální aberace, které odrážely prohlubující se nestabilitu genomu. Nechráněné konce chromozomů dvojitých nbs1-tert mutantů jsou vlivem nehomologního spojování konců chromzomů opravovány, čímž dochází ke vzniku dicentrických chromozomů. Ty se v průběhu anafáze lámou a opětovně dochází k fúzím chromozomů. Cytogenetická analýza byla doplněna také o měření délek telomerových repetic, jež odhalila daleko rychlejší zkracování telomer u dvojitých nbs1-tert mutantů, v porovnání s jednoduchými tert mutanty. Arabidopsis thaliana není jediným rostlinným modelem v biologii telomer. Zástupce nižších rostlin představuje mech Physcomitrella patens, jenž je vzhledem k funkčnímu propojení telomer a reparačních komplexů unikátní, neboť hlavní opravnou dráhou u tohoto organismu je homologní rekombinace. Druhá část dizertace se tak zabývá zejména stanovením exprese a aktivity telomerázy v průběhu vývoje Physcomitrelly a také popisem telomerových fenotypů některých mutantů reparačních drah (Fojtova et al., 2015). Vzhledem k původní nekompletní predikci jsme charakterizovali gen pro trankriptázovou podjednotku (PpTERT) telomerázy. Její aktivita a exprese se mění v souladu s množstvím dělících se apikálních buněk mechu, což odpovídá zjištění u vyšších rostlin. Dalším ze stanovovaných parametrů byla délka telomer, která zůstává v průběhu vývoje mechu stabilní. U vybraných mutantů zejména NHEJ dráhy (mre11, rad50, nbs1, ku70 a lig4) jsme také nedetekovali změnu délek telomerových repetic a zjištění je tak v souladu dominantním postavením homologní rekombinace namísto nehomologního spojování konců. Absence KU70, která u Arabidopsis vede k extrémně prodlouženým telomerám u mechu nezpůsobuje žádný telomerový fenotyp a lze tedy konstatovat, že se Ku70 u Physcomitrelly nepodílí na ochraně telomer.

Abstract:

Genome stability which is nessesary for proper cellular function is ensured by the effective repair system. Without sufficient protection, the ends of linear chromosomes can be recognised as a very harmful type of chromosome damage DNA lession, double-strand breakes. Telomeres, as elaborate nucleo-protein complexes which differentiate chromosome ends from DNA double-strand, also ensure genome integrity together with specific enzyme telomerase. Many telomere-binding protein complexes are associated with telomeres to ensure their proper capping function. It has been found however, that paradoxically, a number of repair complexes also contribute to telomere stability and prevent recombination events and end-to-end fusions. The fisrt part of presented thesis deals with the possible functions of the DNA repair subunit, NBS1, in telomere homeostasis in model plant Arabidopsis thaliana (Najdekrová and Široký, 2011). Although NBS1-deficient plants were viable, lacked any sign of developmental aberration, plants also missing the functional telomerase (double mutants), displayed rapidly, within three generations, severe developmental defects and cells revealed a very early onset of massive genome instability. Chromosomal ends of nbs1-tert mutants are without proper protection and can be healed by non-homologous-end-joining activities to produce dicentric chromosomes. During cell divisions, particularly during anaphase, dicentrics can break, thus producing naked chromosome tips susceptible to additional unwanted chromosome fusions. Our findings were supported with examinination of the length of telomeres in double homozygous mutants where much faster telomere shortening was detected than in plants deficient in telomerase gene alone. Arabidopsis thaliana is not the only one plant model organism in telomere biology. A representative of lower plants is a moss Physcomitrella patens, which has a unique feature in the functional link between telomeres and repair complexes, because of homologous recombination as a main repair pathway. The second part of this thesis deals with the determination of expression and activity of telomerase in various developmental stages of the moss and also with the analysis of telomere-phenotype-selected repair factors (Fojtova et al., 2015). We first characterize the gene coding for the telomerase reverse transcriptase subunit PpTERT in Physcomitrella, for which only incomplete prediction has been available so far. Next, results demonstrate proportionality of telomerase activity and expression with the number of dividing cells, which is in concordance accords with the results obtained in higher plants, also as the stability of telomere lengths during the moss development. The length of telemere tracts in selected, especially NHEJ repair, mutants, (mre11, rad50, nbs1, ku70 a lig4) were also preserved, which is compliant with the overall dominance of homologous recombination over NHEJ pathways in the moss. Particularly, the absence of a telomere phenotype in mutants depleted of KU70, the key factor in NHEJ, whose absence in Arabidopsis results in extremely elongated telomeres, suggest that KU70 is not essential for protection of telomeres in Physcomitrella patens.

Klíčová slova

Arabidopsis thaliana, Physcomitrella patens, oprava dvojřetězcových zlomů, homologní rekombinace, nehomologní spojování konců, TERT, NBS1, Nijmegen Breakage Syndrome, telomeráza

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 2. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 4. 2016
• Vedoucí: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Oponent: doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc., doc. RNDr. David Honys, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Genomika a proteomika