Faktory stability genomu u mechu a vyšších rostlin

Mgr. Ivana Goffová, Ph.D.

Disertační práce

Factors of genome stability in moss and flowering plants

Anotace:

Poruchy stability genomu postihují zejména genomové lokusy s repetitivním charakterem ako telomery a geny pro ribozomální RNA (rDNA), což z nich činí indikátory takových událostí. V této práci prezentujeme studii se zaměřením na tyto citlivé lokusy, která objasňuje roli RAD51, klíčového faktoru homologní rekombinace (HR) katalyzující zásadní krok invaze vlákna, a RTEL1, helikázy antagonistické k RAD51 fungující jako resolváza G-kvadruplexů, v modelové rostlině Physcomitrium patens. Zkoumali jsme, zda ztráta funkce těchto proteinů u odpovídajících mutantů ovlivňuje homeostázu telomer a rDNA, citlivost na poškození DNA a opravu dvouvláknových zlomů (DSB). Zatímco telomery mutanta pprad51-1-2 zůstávají nedotčeny, ztráta RTEL1 vede k dramatickému zkrácení telomer, ačkoli aktivita telomerázy není snížena. Narušení funkce RTEL1 způsobilo jen mírné snížení počtu kopií 5S a 18S rDNA ve srovnání s mutantem s deficitem RAD51. Neočekávaná současná ztráta 5S a 18S rDNA byla v této práci objasněna zjištěním existence spojeného uspořádání zmíněných genů do jednoho klastru, které bylo již dříve předpokládáno, ale teprve v našich experimentech prokázáno. Úrovně transkripce rDNA však neodrážejí přesně změnu počtu kopií, což odpovídá transkripční nezávislosti 5S na 45S rDNA prostřednictvím RNA polymerázy III, resp. I. Navíc nepřítomnost RAD51 a RTEL1 změnila kinetiku opravy DSB směrem k rychlejším drahám (pravděpodobně NHEJ), ačkoli P. patens obecně preferuje využití HR. Dále jsme hodnotili sklon k tvorbě G-kvadruplexů v rDNA jako možné příčiny problémů s replikací a transkripcí a nalezli oblast s potenciálem tvorby G4 v okolí počátku transkripce, který je výrazně vyšší než u telomer. Následně jsme zaměřili naši pozornost na telomerázu, protože udržování telomer je téměř univerzálně zajištěno tímto komplexním enzymem. Ačkoli katalytická podjednotka telomerázy - telomerázová reverzní transkriptáza (TERT) - je u P. patens známá již několik let, její RNA podjednotka (TR) byla stále nepolapitelná. Využili jsme tedy nedávné průkopnické práce z naší laboratoře identifikující TR napříč vyššími rostlinami, abychom zaplnili mezeru ve znalostech o kořenech rostlinného evolučního stromu. Zde uvádíme výsledky bioinformatických predikcí a identifikací TR jako soubor téměř 120 kandidátních sekvencí TR v nižších rostlinách. Tyto výsledky byly validovány na úrovni transkriptů a v případě modelové rostliny P. patens také pomocí přístupů reverzní genetiky. Ztráta funkce TR měla u mutantních linií P. patens za následek ztrátu aktivity telomerázy a výrazné zkrácení telomer.

Abstract:

Perturbations in genome stability are particularly affecting genomic loci with repetitive character as telomeres and ribosomal RNA genes (rDNA) making them indicators of such events. In this thesis, we present the study with focus on these sensitive loci elucidating the role of RAD51, the crucial factor of homologous recombination catalyzing the key step of strand invasion, and RTEL1, the helicase antagonistic to RAD51 functioning as G-quadruplex resolvase, in model plant Physcomitrium patens. We investigated whether the loss of function of these proteins in corresponding mutants affects telomere and rDNA homeostasis, sensitivity to DNA damage and double-strand break (DSB) repair. While telomeres of pprad51-1-2 mutant remain unaffected, the loss of RTEL1 results in dramatic telomere shortening although telomerase activity is not reduced. Disruption of RTEL1 caused just moderate copy number reduction of 5S and 18S rDNA in comparison to mutant with RAD51 deficiency. The unexpected simultaneous loss of 5S and 18S rDNA was clarified in this work by finding the existence of linked arrangement of mentioned genes to one cluster, which was previously assumed, but demonstrated only in our experiments. However, the levels of rDNA transcription do not accurately reflect the change in copy numbers, which corresponds to the transcriptional independence of 5S from 45S rDNA via RNA polymerase III and I, respectively. Moreover, absence of RAD51 and RTEL1 changed the kinetics of DSB repair towards more faster pathways (probably NHEJ), although P. patens generally prefers the use of HR. We further evaluated the propensity of G-quadruplex formation within rDNA as possible cause of replication and transcription problems and found a region with G4 formation potential around the transcription start site, which is significantly higher than in telomeres. Subsequently, we aimed our attention to telomerase as the telomere maintenance is almost universally provided by this complex enzyme. Although the catalytic subunit of telomerase- telomerase reverse transcriptase (TERT)- has been known for several years in P. patens, its RNA subunit (TR) was still elusive. We took the advantage of recent groundbreaking work from our laboratory identifying the TRs across higher plants to fill the gap in knowledge about the roots of plant evolutionary tree. Here we present the results of bioinformatic predictions and identification of TRs as a set of almost 120 candidate TR sequences in lower plants. These results were validated at the transcript level and, in the case of the model plant P. patens, also using reverse genetics approaches. Loss of TR function resulted in loss of telomerase activity and marked telomere shortening in mutant P. patens lines.

Keywords

Physcomitrium patens, telomery, ribosomální RNA geny, stabilita genomu, RAD51, RTEL1, telomeráza, evoluce, TR, telomeres, ribosomal RNA genes, genomic stability, telomerase, evolution

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 11. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 12. 2021
• Vedoucí: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Oponent: RNDr. Roman Hobza, Ph.D., prof. RNDr. David Honys, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Genomika a proteomika / Genomika a proteomika