Buněčný model ribozomálního stresu

Bc. Martin ONDRA

Master's thesis

Cell model of ribosomal stress

Abstract:

Diplomová práce se zabývá studiem ribozomálního stresu. V teoretické části diplomové práce jsou shrnuty základní poznatky a informace o jadérku, ribozomální biogenezi, Mdm2, p53 a ribozomálním stresu dependentním a independentním na p53. V praktické části byly vytvořeny vektory exprimující fúzní nukleolin (NCL) a fibrilarin (FBL) se zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) na jejich N-konci. Transfekcí lidských U2OS buněčných linií plazmidy exprimujícími GFP-NCL a následnou selekcí byla vytvořena stabilní buněčná linie s fluorescenčně značeným nukleolinem (U2OS-pEGFP-NCL). Transfekcí U2OS buněčné linie plazmidy exprimujícími GFP-FBL a následnou selekcí byla vytvořena buněčná linie s fluorescenčně značeným fibrilarinem (U2OS-pEGFP-FBL). Pro validaci FBL a NCL jako možných márkrů ribozomálního stresu, byla na vytvořené U2OS-pEGFP-FBL a U2OS-pEGFP-NCL buněčné linie aplikována vybraná cytostatika, která narušují ribozomální biogenezi. Po aplikaci cytostatik byla následně provedena double rRNA fluorescenční in situ hybridizace na specifické oblasti rRNA. Cisplatina, oxaliplatina a aktinomycin-D způsobily rozpad integrity jadérka a uvolnění FBL a NCL z jadérka do jádra, zatímco 5-fluorouracil neovlivnil integritu jadérka a lokalizaci FBL a NCL. Z výsledků double rRNA FISH bylo patrné, že cispaltina, oxaliplatina a aktinomycin-D zablokovaly transkripci 47S rRNA, ale neblokovaly zpracování pre-rRNA. Aplikace 5-fluorouracilu způsobila zastavení zpracování pre-rRNA, avšak transkripce 47S rRNA nebyla ovlivněna. Buněčná linie U2OS-pEGFP-NCL byla transfekována siRNA-RPL11 pro umlčení exprese RPL11. Deplece RPL11 nezpůsobila rozpad integrity jadérka a nedošlo ke spuštění p53 dependentního ribozomálního stresu. U buněk transfekovaných siRNA-RPL11byla identifikována akumulace pre-rRNA prekurzorů. Kombinace určení lokalizace těchto fluorescenčně značených proteinů s metodou double rRNA FISH pro specifické oblasti na pre-rRNA, se ukázala být vhodným systémem pro identifikaci látek, které mohou způsobovat ribozomální stres.

Abstract:

The theoretical part of the diploma thesis summarizes information about nucleolus, ribosomal biogenesis, Mdm2 and p53 dependent and independent ribosomal stress. In the experimental part, vectors expressing nucleolin (NCL) and fibrillarin (FBL) fused with green fluorescent protein at its N-terminus were created. Transfection of human U2OS cells with plasmids expressing GFP-NCL and subsequent selection resulted in a stable fluorescent- labeled nucleoline (U2OS-pEGFP-NCL) cell line. By transfecting the U2OS cell line with plasmids expressing GFP-FBL and subsequent selection, fluorescent-labeled fibrillarin cell line (U2OS-pEGFP-FBL) was created. For the validation of FBL and NCL as possible markers of ribosomal stress, selected cytostatics known to disturb ribosomal biogenesis have been applied to U2OS-pEGFP-FBL and U2OS-pEGFP-NCL cell lines. Double RNA fluorescent in situ hybridization on specific rRNA locus was performed after application of cytostatic. Cisplatin, oxaliplatin and actinomycin-D caused the breakdown of the nucleus integrity and the release of FBL and NCL from the nucleolus to the nucleus, whereas 5-fluorouracil did not affect the integrity of the nucleus and the localization of FBL and NCL. From the results of the double rRNA FISH was evident that cisplatin, oxaliplatin and actinomycin-D blocked transcription of 47S rRNA, but did not block processing of pre-rRNA. Application of 5-fluorouracil caused stopping pre-rRNA processing, but transcription of 47S rRNA was not affected. The U2OS-pEGFP-NCL cell line was transfected with siRNA-RPL11 to silence expression of RPL11. The RPL11 depletion did not cause the loss of integrity of the nucleus and did not trigger p53 dependent ribosomal stress. Cells transfected with siRNA-RPL11 have been identified to accumulate pre-rRNA precursors. The combination of localization of these fluorescently labeled proteins with the double rRNA FISH method for pre-rRNA specific regions has proven to be a suitable system for identifying substances that may cause ribosomal stress.

Keywords

Mdm2, p53, ribozomální stres, U2OS, double rRNA FISH, GFP, ribozomální proteiny, jadérko, fibrilarin, nukleolin, RPL11

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 5. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Bc. Zuzana Macečková

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology