Příprava a základní charakterizace fúzních proteinů složených z PDZ3_ZO-1 a GA88

Mgr. Jan Hurdálek

Advanced ('rigorózní') thesis

The preparation and basic characterization of fusion proteins composed of PDZ3_ZO-1 and GA88

Abstract:

Fúzní proteiny jsou arteficiální proteiny připravované spojením dvou a více proteinovýchdomén, zpravidla pomocí genového inženýrství. Jsou dnes široce uplatňovány v medicíně,vědě i chemickém průmyslu, nicméně nové poznatky o mezidoménovém ovlivňování majípotenciál odvětví designu a přípravy funkčních fúzních proteinů nebývale akcelerovat.Fúzní proteiny představené v této práci, FD5A a FD6A, jsou složeny z PDZ3 doményproteinu ZO-1 a arteficiální chameleonské domény GA88 a molekulárním modelovánímin silico u nich byla predikována významná mezidoménová ovlivnění mechanismemdynamické alosterie. FD5A a FD6A s histidinovými kotvami byly v rámci této práceexprimovány v E. coli a purifikovány pomocí afinitní chromatografie s imobilizovanýmiionty kovů, dále byly kotvy z proteinů odstraněny pomocí štěpení TEV proteasoua subtraktivní afinitní chromatografie a proteiny byly přečištěny pomocí vylučovaníchromatografie. Následovala charakterizace několika biofyzikálními metodami: analytickévylučovací chromatografie, dynamického rozptylu světla, analytické ultracentrifugace,cirkulárního dichroismu a diferenciální skenovací fluorimetrie. Bylo zjištěno, že ačkoliv seproteiny FD5A a FD6A prakticky neliší terciární ani sekundární strukturou, jejich tepelnástabilita je výrazně odlišná, což poukazuje na vzájemné vzdálené ovlivňování doménv těchto fúzích.

Abstract:

Fusion proteins are artificial proteins prepared by connecting of two or more proteindomains, generally with usage of genetic engineering methodology. Today, they are widelyused in medicine, science and chemical industries, but new research in interdomaincommunication has the potential to accelerate the field of fusion protein design andpreparation even further. For fusion proteins introduced in this work, FD5A and FD6A,comprised of the PDZ3 domain of the protein ZO-1 and artificial chameleon domain GA88,significant interdomain influencing via the mechanism of dynamic allostery was predictedby molecular modelling in silico. In this thesis, FD5A and FD6A with histidine tags wereexpressed in E. coli and purified using immobilised metal affinity chromatography; the tagswere cleaved with TEV protease and proteins were separated with subtractive affinitychromatography. Furthermore, characterisation using several biophysical methods such assize-exclusion chromatography, dynamic light scattering, analytical ultracentrifugation,circular dichroism, and thermal shift assay was successfully attempted. It was determinedthat even though FD5A and FD6A do not vary in secondary nor tertiary structure, theirthermal stability is significantly different, which suggests mutual, long-distance influence ofthe two domains in these fusions

Keywords

proteiny fúzní, proteiny chimérické, PDZ domény, PDZ3 ZO-1, proteiny chameleonské, GA88, alosterie dynamická

Keywords

fusion proteins, proteins chimeric, PDZ domains, PDZ3 ZO-1, chameleon proteins, GA88, allostery dynamic

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 2. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 5. 4. 2024
• Supervisor: doc. RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D.
• Reader: PharmDr. Rudolf Andrýs, Ph.D.

University of Hradec Králové

Faculty of Science

/ field:
Chemie / Toxikologie a analýza škodlivin