Detekce a kvantifikace mykobakterií v různých typech vod pomocí molekulárně biologických metod

Bc. Anna Hyžáková

Diplomová práce

Detection and quantification of mycobacteria in different types of water using molecular biology methods

Anotace:

Mykobakterie jsou široce rozšířené v přirozeném prostředí včetně vody. Nachází se v různých typech vod, od vod přírodních povrchových, vody ve vířivkách a bazénech až po vodu kohoutkovou. Právě prostřednictvím vody dochází často ke kontaktu lidí s mykobakteriemi a tento kontakt může představovat zdroj infekce. Mezi významné oportunně patogenní zástupce, kteří se mohou ve vodě vyskytovat, patří i zástupci Mycobacterium avium komplex (MAC). Voda je důležitým zdrojem infekce této skupiny podmíněně patogenních mykobakterii u lidí. Práce je zaměřena na optimalizaci metody kvantitativní real-time PCR pro detekci zástupců rodu Mycobacterium a zástupců patřících do MAC ve vodách. Tato optimalizovaná metoda byla použita pro detekci a kvantifikaci ve vzorcích různých typů vod (studniční, kohoutková, surová, povrchová) v České republice. Celkem bylo zpracováno 31 vzorků, z nichž 0 (0 %) bylo pozitivní na přítomnost MAC a 31 (100 %) bylo pozitivní na přítomnost zástupců rodu Mycobacterium. Nejméně mykobakterií bylo detekováno ve studniční vodě a nejvíce ve vodě povrchové. Během úpravy vody na pitnou nebyla pozorována redukce počtu přítomných mykobakterií. V upravených vodách bylo zjištěno 6,68 × 104 a 3,40 × 105 mykobakteriálních buněk v 1 l vody. Byla také stanovena bakteriální diverzita pomocí 454 pyrosekvenování úseku genu pro 16S rRNA. Diverzita byla stanovena u vzorků různých typů vod (studniční, kohoutková, surová, povrchová) a vzorků z kalu a filtrů. Bylo zjištěno, že nejvíce zastoupené kmeny bakterií (Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes) jsou shodné v různých typech vzorků, liší se pouze jejich percentuální zastoupení. Pouze několik kmenů zahrnovalo velkou část zástupců. Většina kmenů ale byla zastoupena pouze malým množstvím bakterií a velké množství kmenů se ve vzorcích vyskytovalo v množství menším než 1 %. Tyto málo zastoupené kmeny představují hlavní zdroj bakteriální diverzity ve vodě. Během úpravy vod došlo k výraznější změně bakteriální diverzity v úpravně, která při úpravě používá více kroků, ve srovnání s úpravnou používající pouze filtraci a chloraci.

Abstract:

Mycobacteria are widely distributed in the natural environment including water. They can be found in different types of water ranging from natural surface water, hot tub and swimming pool water, to tap water. Water functions as a mediator between the people and mycobacteria and this contact can be a source of infection. Mycobacterium avium complex (MAC) belongs to the category of important opportunistic pathogens that can be present in the water. Water represents an important source of infection caused by MAC for humans. This diploma thesis is focused on optimising of quantitative real-time PCR method for detection of the genus Mycobacterium and MAC in waters. This optimized method was used for detection and quantification in samples of different types of water (well, tap, raw, surface) in the Czech Republic. 31 samples were analysed; MAC was detected in 0 (0 %) samples and 31 (100 %) were positive for the genus Mycobacterium. The lowest numbers of mycobacteria were found in well water and the highest numbers were observed in surface waters. Reduction of mycobacteria numbers was not observed during the water treatment process. We found out that there are 6.68 × 104 and 3.40 × 105 cells of mycobacteria in 1 l of treated water. 454 pyrosequencing of part of gene for 16S rRNA was used for determination of the bacterial diversity. Diversity of different types of water (well, tap, raw, surface) and of samples of sludge and filters was determined. It was found that the most abundant phyla of bacteria (Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes) were coincident in all types of samples, the difference was just percentage of the phyla. Only a few phyla included a large part of bacteria. Majority of phyla were represented by a small amount of bacteria and there was also large number of bacterial phyla that occurred in the samples in an amount smaller than 1%. These phyla represented by low numbers of bacteria represent a major source of bacterial diversity in water. The use of water treatment plant with multiple steps leads to a greater change of bacterial diversity in comparison with water treatment plant which uses only chlorination and filtration.

Klíčová slova

netuberkulózní mykobakterie, NTM, voda, Mycobacterium avium komplex, molekulárně biologické metody, real-time PCR, pyrosekvenování, nontuberculous mycobacteria, water, Mycobacterium avium complex, molecular biology methods, pyrosequencing

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2015
• Vedoucí: Ing. Marija Kaevska, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Speciální biologie