Humorální imunitní systém včel (Apis mellifera) v různém vývojovém stádiu a věku

Bc. Michaela SVITÁKOVÁ

Diplomová práce

Humoral immunity of honey bees (Apis mellifera) in different developmental stage and age

Anotace:

Včela medonosná (Apis mellifera) má podstatný význam pro úroveň opylování hospodářských a planných plodin. Hmyz postrádá získanou složku imunitního systému, obranyschopnost tak zajišťuje pouze imunita vrozená. Charakteristickým prvkem nespecifické humorální imunity je rychlá syntéza antimikrobiálních peptidů uskutečňující se především v tukovém tělese a následná sekrece do hemolymfy. V hemolymfě včely medonosné byly doposud detekovány antimikrobiální peptidy abaecin, apidaeciny, defensin-1 a hymenoptaecin, vystupující jako velmi účinné efektorové molekuly vůči napadení mikrobiálními patogeny. V této práci bylo provedeno porovnání relativní kvantifikace exprese genů kódujících výše zmíněné antimikrobiální peptidy včel a larev vystavených bakteriálním patogenům. Larvy byly infikovány různými koncentracemi spor Paenibacillus larvae přidanými do mateří kašičky, kterou byly po dobu 4 dnů v laboratorních podmínkách krmeny. I přesto, že larvám byl patogen podán přímo potravou, nebylo u těchto jedinců v porovnání s kontrolou pozorováno významné ovlivnění hladiny exprese genů antimikrobiálních peptidů. Dospělé včely byly po narkotizaci oxidem uhličitým imunizovány vpichem pod kutikulu roztokem PBS a tímto roztokem obohaceným o suspenzi bakterií Escherichia coli a Paenibacillus larvae. Hladina exprese všech čtyř pozorovaných genů u dospělců byla oproti kontrolní skupině statisticky významně zvýšena především v případě experimentální skupiny včel imunizovaných fyziologickým roztokem s bakteriální suspenzí. Avšak také imunizace samotným roztokem PBS, který by měl působit jako fyziologický roztok, vyvolala oproti kontrole zvýšenou expresi všech čtyř porovnávaných genů. Lze tak pozorovat úzká souvislost všech tří linií imunitního systému. Tedy, že i na narušení fyzikálních bariér, v tomto případě kutikuly, je humorální imunitní systém připraven rychle reagovat. Byl optimalizován postup pro imunochemickou detekci antimikrobiálních peptidů defensinu-1 a abaecinu z tkání včely medonosné metodou Western blotting. V homogenátech zadečků včel, jejichž extrakci v 0,1% TFA s následnou lyofilizací předcházelo vypreparování trávicího traktu, byl u klinicky zdravých i imunizovaných jedinců detekován 5,5 kDa peptid defensin-1. V hemolymfě včel nebyl detekován ani abaecin ani defensin-1. V tomto biologickém materiálu byla zřejmě velmi nízká koncentrace cílových analytů pro detekci Western blottingem.

Abstract:

Honey bee (Apis mellifera) has a major importance for the level of pollination of agricultural and wild-growing crops. Insect lack the acquired component of immune system and the resistence is provided only by the innate immunity. The typical attribute of the non-specific humoral immunity is a rapid synthesis of antimicrobial peptides which is realised especially in the fat body, followed by their secretion into the haemolymph. Antimicrobial peptides abaecin, apidaecins, defensin-1 and hymenoptaecin were detected in the haemolymph of honey bees so far. These peptides act as effector molecules against microbial pathogens. This thesis brings the comparsion of relative quantification of genes expression coding antimicrobial peptides mentioned above and between bees and larvae after exposure to bacterial pathogens. The larvae were infected by different concentrations of spores of Paenibacillus larvae added into royal jelly. Larvae were fed in vitro conditions for 4 days. In spite of the pathogen being given directly in food to the larvae, significant impact on the level of gene expression of antimicrobial peptides in comparsion to controls was not observed. Adult bees were immunized by a subcuticular injection of the PBS solution and of PBS solution enriched by a suspension of Escherichia coli and P. larvae bacteria. The expression level of all four genes of interest were significantly increased compared to control group. The group immunized by PBS and bacteria suspension displayed the highest gene expression. However, also immunization by PBS alone induced increased expression level of all four genes compared to control non-immunized group. Even the disruption of physical barriers, in this case of cuticle, the hummoral immune system is prepared for quick reactions such as expression of genes of antimicrobial peptides. Western blotting technique was optimized for imunochemical detection of antimicrobial peptides defensin-1 and abaecin from tissues of honey bees. Extraction of homogenized bee abdomens without digestive tract in 0,1% TFA with additional lyofilization was detected 5,5 kDa peptide defensin-1 in clinically healthy as well as in immunized individuals. Abaecin and defensin-1 were not detected in haemolymph of bees. There was apparently very low concentration of target analytes in this biological material fot detection by Western blotting.

Klíčová slova

včela medonosná, humorální imunita, antimikrobiální peptidy, genová exprese, Western blotting

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 28. 5. 2019
• Vedoucí: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie