Molekulární detekce mutací genů zodpovědných za progresivní retinální atrofii u psů

Lenka Rosenkranzová

Bachelor's thesis

Molecular detection of genes mutations responsible for progressive retinal atrophy in dogs

Anotácia:

Tato bakalářská práce na téma "Molekulární detekce mutací genů zodpovědných za progresivní retinální atrofii u psů" je rozdělena na část teoretickou a praktickou. V teoretické části jsem se v literárním přehledu zaměřila na kandidátní geny a molekulární charakteristiku mutace vedoucí ke vzniku progresivní retinální atrofie napříč psími plemeny, dále pak na způsoby dědičnosti tohoto onemocnění. Jedním z důvodů volby genu PRCD bylo, že identická kauzální mutace je jednou z možných příčin vzniku lidského onemocnění retinitis pigmentosa. A pes domácí z tohoto důvodu může sloužit jako vhodný genetický model pro studium dopadu mutace genu PRCD na projevy tohoto rozšířeného a kvalitu života snižujícího onemocnění. Z literárního přehledu je zřejmé, že existuje několik kandidátních genů, jejichž kauzální mutace zapříčiňují vznik progresivní retinální atrofie u psů, dále jen PRA. Způsob dědičnosti je u těchto mutací různý od autozomálně dominantního, autozomálně recesivního, až k dědičnosti vázané na pohlaví, přesněji na gonozóm X. Některé typy mutací se váží pouze na určité plemeno nebo na skupinu plemen. To pravděpodobně souvisí s tím, že ke vzniku takto vázané mutace došlo pouze u psů, kteří se museli konkrétně podílet na vzniku daného plemene. Praktická část byla zaměřena na izolaci DNA z bukální sliznice psů ze 48 plemen a 15 kříženců, dále na optimalizaci PCR-RFLP markeru a přímou sekvenaci získaných PCR amplikonů. V průběhu výzkumu došlo k potvrzení hypotézy, že mutace genu PRCD vykazuje recesivně autozomální způsob dědičnosti. Ani jeden z analyzovaných psů nevykazoval žádný z typických oftalmologických příznaků PRA. U deseti jedinců z celkového počtu 420 testovaných došlo k identifikaci mutované alely genu PRCD. Rovněž byla zjištěna mutovaná alela genu PRCD u dosud neprostudovaných plemen a to u šarplaninského pasteveckého psa a velkého knírače. Jedním z cílů bakalářské práce bylo provedení sekvenace genu PRCD, dále vypracování bioinformatických analýz a porovnání In silico analýz. Sekvence markeru genu PRCD se porovnaly s mezinárodními nukleotidovými databázemi Ensembl a NCBI a byla zjištěna maximální (100%) sekvenční shoda. Bioinformatické analýzy potvrdily výsledek, který, je plně v souladu s publikovanými informacemi a to takový, že detekovaná mutace způsobuje změnu aminokyseliny (cystein je nahrazen tyrozinem). V In silico analýzách byla zjištěna vysoká sekvenční homologie u jednotlivých ortologů genu PRCD různých savců, včetně člověka. Dále došlo k potvrzení hypotézy, že gen PRCD kóduje značně konzervativní protein, který je zcela nezbytný pro správné funkci zraku savců. V závěru práce navrhuji vzhledem k výsledkům výzkumu, ke zvážení chovatelským klubům mírně přísnou selekci, která bude stát na základech genetických testů a mohla by z dlouhodobého hlediska vést ke snížení frekvence mutované alely genu PRCD.

Abstract:

This bachelor thesis entitled "The molecular detection of gene mutation responsible for progressive retinal atrophy in dogs" is divided into theoretical and practical part. The first mentioned deals with candidate genes, the molecular characteristics of mutation responsible for progressive retinal atrophy and its heritability across all dog breeds. I picked up PRCD gene because of its similarity to the one of possible causes of retinitis pigmentosa disease in human. That is why dog can be considered as suitable genetic paragon for studying PRDC gene mutation effect to the manifestation of this wide spread and life obstructing disease. Based on the literature review it is apparent that there are several candidate genes causal mutations that result in PRA development in dogs. The way of inheritance in these different mutations varies from autozómal dominant, autozómal recessive, to the sex-linked inheritance - X gonosome more accurately. There are some types of mutations that are bound to certain breed or group of breeds only. Those probably originate in primary mutation, that developed in individuals that gave rise to those particular breeds. The practical part deals with DNA isolation from buccal mucosa of the dogs (48 breeds and 15 crossbreeds used). It follows up PCR-RFLP marker optimalization and PCR amplicons direct sequenation. During experiment PRCD autozómal recessive heritability hypothesis has been proven truthful. None of the dogs analyzed exhibited any of the typical ophthalmological symptoms of PRA disease. PRCD gene mutated allele has been proven in 10 individuals from the total amount of 420. The presence of PRCD gene mutated allele has been newly proven in Yugoslavian Shepherd Dog - Sharplanina and Giant Schnuazer. The other goal of this bachelor thesis was PRCD gene sequenation and consequent bionformatical analysis and In silico analysis comparison. PRCD gene marker sequences have been compared to Ensemble and NCBI international nucleotide databases and 100% sequenation conformity have been proven. Bioinformatical analyses have confirmed the result perfectly consistent with information published. The mutation detected causes cystein -- tyrosine amino acid confusion. In silico analyses have proven high sequention homology in PRCD gene ortologs of various mammals, human included. It also has been proved that PRCD gene codes highly conservative protein essential to proper vision of mammals. At the end of this thesis, based on experimental data, I suggest less strict but genetic test supported selection of breeding dogs. This approach could reduce PRCD gene mutated allele frequency in dog population in the long-term perspective.

Kľúčové slová

pes, Canis lupus familiaris, gen PRCD, mutace, progresivní retinální atrofie, PCR-RFLP

Keywords

progressive retinal atrophy, dog, Canis lupus familiaris, PRCD gene, mutations, PCR-RFLP

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 4. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / odbor:
Animal Science / Cynology