Konzervace ejakulátu hřebců pro využití v umělé inseminaci

Petra Hašková

Bachelor's thesis

Preservation of stallion ejaculate for use in artifical insemination

Abstract:

V dnešní době je inseminace nejběžnější metodou reprodukce koní. Využívají se čerstvé, chlazené a mražené inseminační dávky. Dostatečná koncentrace motilních a nepoškozených spermií je předpokladem úspěchu. K dosažení kvality dávky potřebujeme zdravého dobře živeného hřebce, vybavení, zkušenost a správnou přípravu. Proces začíná odběrem ejakulátu, jeho makroskopickým a mikroskopickým zhodnocením. Obvykle následuje centrifugace, která má za cíl odstranit semennou plasmu. Centrifugaci nepotřebujeme provádět, pokud byla odebrána pouze na spermie bohatá frakce. Ke spermiím je přidáno ředidlo, které chrání membránu při chlazení/mražení a dalších manipulacích a má funkci výživy. Ředidla se v zásadě dělí na mléčná a žloutková. Základem mléčného je odtučněné sušené mléko a glukóza. U žloutkového vaječný žloutek s přídavkem glycinu. K ředidlům se přidávají pufr, antibiotika a cukry. Pro mražení se využívá kryoprotektivních vlastností těchto látek. Nejrozšířenější látkou je glycerol. Zprvu byl používaný u skotu. Reakce hřebčích spermií je různá. Výraznou nevýhodou je toxicita. Používá se v koncentraci okolo 2.5% v závislosti na ředidle. Vaječný žloutek byl zprvu zkoušen na býčích posléze hřebčích spermiích. Jde o neinvazivní kryoprotektivum, kde obsah LDL a fosfolipidů přispívá k ochraně integrity plasmatické membrány během fáze mražení a tání. Žloutek lze nahradit LDL. Glutamin je využitelný u dobře mrazitelných hřebců, kde v nízkých dávkách snižuje toxicitu glycerolu a po rozmražení zlepšuje progresivní motilitu. Med je bohatým zdrojem sacharidů, vitamínů skupiny B a minerálů. Ve směsi s vaječným ředidlem prokazatelně pozitivně působil na motilitu. Obsažená fruktóza a glukóza působí jako nepenetrující extracelulární kryoprotektant udržující osmotickou rovnováhu. Kryoprotektiva umožňují spermiím projít mražením v párách tekutého dusíku, a posléze do něho být v pejetách o objemu 0.5 ml uloženy, a přečkat teplotu -196°C. Mraženy mohou být i epididymální spermie, které se odebírají po eutanázii nebo nečekaném úhynu hřebce z ocasu nadvarlete a chámovodu. Touto cestou je možné vyrobit cca 20 inseminačních dávek. Spermie je vhodné inseminovat hysteroskopicky do děložního rohu nebo je použít na metodu ICSI. Mražené dávky jsou nástrojem pro uchování genů plemen málopočetných, cenných či zařazených do genových zdrojů. Ejakulát je pomalu chlazen a plněn do stříkaček. Chlazené dávky jsou baleny do přepravních kontejnerů s chladící vložkou, které udrží teplotu až 48 hodin. Po té se expedují. Inseminace standardně probíhá do 24 hodin po odběru. Koncentrace spermií se běžně pohybuje okolo 300×106/ml. Při odběru je důležité zacházet s ejakulátem citlivě, odebírat do předehřátých nástrojů, dbát na hygienu, zamezit kontaminaci a zbytečně neriskovat chladový šok spermií. Při vlastním aktu inseminace je opět nutné dbát na správnou teplotu. Celý proces skýtá hodně prostoru pro chyby, snažme se jim aktivně vyvarovat.

Abstract:

These days, artificial insemination is commonly used method in horse reproduction. Fresh, cooled and frozen insemination doses are used. The assumption is that satisfactory concentration of motile unharmed spermatozoa will provide us success. To achieve this goal, we need healthy and well fed stallion, proper equipment, experiences and to be well prepared. Everything starts with ejaculate collection and its macroscopic and microscopic evaluation. When everything is all right, it is followed by centrifugation. The purpose of centrifugation is to remove seminal plasma, which is unwanted for further semen preservation. We do not need to centrifugate, when we choose to collect only gel-free fraction. Spermatozoa is mixed with dilutant. Its purpose is to protect the spermatic membrane in proces of cooling/freezing and further manipulation. The dilutant has nourishing function too because we have removed seminal plasma. Dilutants can be divided into two main groups: egg-based and milk-based. The milk-based is mixture of non-fat dried milk and glucose. The egg-based combines egg-yolk and glycine. We add buffer, antibiotics and sugar in to dilutants. We use cryopreservative properties of these substances. Glycerol is commonly used substance widely used in cattle. Reaction of equine spermatozoa differs. Its toxicity is the biggest disadvatage. The used concentration is dependant on dilutant and is about 2.5%. The egg yolk was firstly used in cattle then in equine spermatozoa. It is noninvasive cryopreserving agent. Content of LDL and phospholipids contributes to protection of plasmatic membrane integrity during freezing and thawing phase. The egg-yolk can be completely replaced by LDL. Glutamine is useable in good freezing stallions. In low dose use, it reduces the glycerol toxicity and improves progresive motility after thaw. Honey is good source of sugars, B vitamins and minerals. It clearly positively acts to progresive motility in a mixture of honey and egg-yolk. The content of glucose and fructose act as non-penetrative extracellular cryopreserving agent. It keeps osmotic balance. Cryopreservatives allows the sperm cells to be freezed in fumes of liquid nitrogen and then to be frozen in straws below -196°C. Epididymal spermatozoa can be frozen too. These are taken after euthanasia or unexpected death from the tail of epididymis and vas deferens. We can prepare up to 20 insemination doses. Spermatozoa can be used in ICSI or inseminated to uterine horn hysteroscopicaly. Frozen doses are tool of protection to rare, valuable or gene source breeds. After dilution, ejaculate is slowly cooled and filled into 5 ml siringe. Cooled ejaculate (4-6°C) is packed into transport container which can hold the temperature up to 48 hours. A mare is inseminated in 24 hours after collection. The spermatozoa concentration is about 300×106/ml. It is important to treat the ejaculate gently, use and collect into pre-warmed vessel and equipment, keep hygiene, prevent contamination and do not risk cold shock. Keep right temperature in the actual process of insemination. In the proces, there is a lot of room to make mistakes. Try to actively avoid them.

Keywords

hřebec, ejakulát, ředidlo, umělá inseminace, kryokonzervace

Keywords

ejaculate, extender, artificial insemination, cryopreservation, stallion

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Martina Janošíková

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Animal Science / Horse Breeding