Využití moderních separačních metod v metabolomickém výzkumu

Bc. Andrea Celá, Ph.D.

Doctoral thesis

Application of modern separation techniques in metabolomic research

Abstract:

Tato práce se zaměřuje na využití kapilární elektroforézy k neinvazivnímu hodnocení metabolismu lidských embryí. Neplodnost a její rostoucí prevalence je palčivým problémem moderní civilizace a postihuje celosvětově přibližně 15% párů v reprodukčním věku, ve vyspělých zemích dokonce 20-25%. Neplodné páry vyhledávají pomoc a využívají nástroje asistované reprodukce. K nejúspěšnějším se řadí oplodnění pomocí intracytoplazmatické injekce spermií a kultivace embryí po krátkou dobu následované transferem do dělohy. Úspěšnost otěhotnění koreluje s vývojovým potenciálem transferovaného embrya, a proto je správný výběr nejlepšího embrya předmětem výzkumu. Hodnocení vývojového potenciálu embryí je založeno na světelné mikroskopii, ačkoli je velmi subjektivní a rozhoduje vzhled embrya, než jeho funkčnost. Proto je snaha najít objektivní a ideálně neinvazivní metody pro hodnocení vývojového potenciálu embryí. Mezi ostatními omickými disciplínami vyniká metabolomika, která odráží nejaktuálněji informace o stavu embrya. Neinvazivního stanovení lze docílit vyhodnocením koncentračních změn metabolitů obsažených v kultivačním médiu. Důraz byl kladen na aminokyseliny, protože mají zásadní význam pro správný vývoj embrya. Kapilární elektroforéza ve spojení s fluorescenční detekcí je mocný analytický nástroj, který umožňuje citlivé stanovení s minimálními požadavky na objem vzorku. Proto byly vyvíjeny metody založené na kapilární elektroforéze pro stanovení koncentračních změn aminokyselin v použitých kultivačních médiích. Byly navrženy a optimalizovány dva přístupy umožňující automatickou derivatizaci aminokyselin v kapiláře. S ohledem na analytická omezení těchto metod, které brání jejich klinickému použití, byl nakonec upřednostněn tradiční přístup derivatizace v mikrozkumavce. Tato metoda vykazovala analytické vlastnosti vhodné pro klinické použití a byla využita pro studii metabolismu embryí rozmrazených a kultivovaných při různých koncentracích kyslíku a pro studii koncentračních změn aminokyselin u embryí, která se dále vyvíjela, a která se ve vývoji zastavila.

Abstract:

This thesis is focused on application of capillary electrophoresis for noninvasive evaluation of human embryo viability. Infertility with its growing prevalence is burning concern of modern civilization affecting worldwide about 15% of couples in reproductive age, even 20-25% in developed countries. Infertile couples seek help and use tools of assisted reproduction. Currently, the most successful treatment is in vitro fertilization using intracytoplasmic sperm injection and cultivation of embryos for a short period of time before its transfer to the uterus. The success rate correlates with developmental competence of the transferred embryo, thus the proper selection of the most competent embryo is a subject of ongoing research. Evaluation of the developmental competence is based on light microscopy, although it is highly subjective and the decision is made according to the embryo’s appearance rather than functionality. As a result, a novel tool allowing objective and ideally noninvasive assessment of the developmental competence of embryo is sought. Among the other omics disciplines, the metabolomics stands out as it reflects the most actual state of an embryo. Noninvasiveness can be accomplished by analysis of turnover of metabolites (released/depleted) in culture media. The emphasis was put on amino acids, since they are essential for proper embryonic development. Capillary electrophoresis coupled to fluorescence detection is a powerful analytical tool and allows sensitive analysis with minimal sample volume requirements. As a result, the capillary electrophoretic methods focused on determination of turnover of amino acids in spent culture media were developed. Two automatic on capillary derivatization approaches were proposed and optimized. Considering the analytical limitations of these methods hampering their clinical use, the most traditional pre capillary derivatization was finally preferred. This method showed analytical qualities for clinical use and was employed in study of embryo metabolomics cultured after thawing under different oxygen concentrations and in complex study of turnover of amino acids between embryos with progressive development and arrested embryos.

Keywords

kapilární elektroforéza, aminokyseliny, fluorescenční detekce, metabolomika, lidské embryo capillary electrophoresis, amino acids, fluorescent detection, metabolomics, human embryo

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 11. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 11. 12. 2020
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
• Reader: prof. Ing. Ivan Mikšík, DrSc., prof. RNDr. Ing. Petr Tůma, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry