Matrix assisted laser desorption ionization for characterization of higher molecular thiols in biological samples

Miguel Angel Merlos Rodrigo, MSc.

Doctoral thesis

Use of mass spectrometry technique (MALDI-TOF) for the characterization of metallothionein in biological systems

Abstract:

Mezi nejlépe charakterizované kov-vázající ligandy v buňkách patří fytochelatiny (PC) a metalothioneiny (MT). PC a MT jsou rozdílné třídy molekul, které jsou bohaté na obsah cysteinů. PC jsou enzymaticky syntetizované peptidy, zatímco MT jsou geneticky kódované polypeptidy. Pro analýzu PC, MT a komplexů těžkých kovů bylo v rozdílných studiích využito několik analytických metod. V současné době je metoda, spojující matricí asistovanou laserovou desorpci/ionizaci s hmotnostním analyzátorem doby letu (MALDI-TOF MS), známá pro její snadnou obsluhu a pro využívání levných matric a chemikálií pro přípravu vzorků. Mnohem důležitější ale je, že je tuto metodu lze plně automatizovat. V této studii jsme určili vhodné podmínky pro charakterizaci fytochelatinu PC2 a komplexu Cd-PC2 pomocí MALDI-TOF MS. Dále byly exprimovány geny lidských metalothioneinů MT2A a MT3klonováním v heterologních organismech (Escherichia coli). Dále byl izolován MT2 protein z králičích jater. MT byly purifikovány pomocí rychlé proteinové kapalinové chromatografie (FPLC). Předkládaná práce demonstruje využití MALDI-TOF MS pro charakterizaci různých isoforem MT. Bylo využito také elektrochemických metod pro potvrzení vzniku thiolových komplexů s kovovými ionty. Navíc byl navržen snadno použitelný nástroj pro izolaci MT, využívající jednoduchou a plně automatizovanou elektrochemickou detekční techniku

Abstract:

Among the heavy metal-binding ligands in cells the phytochelatins (PCs) and metallothioneins (MTs) are the best characterized. PCs and MTs are different classes of cysteine-rich, heavy metal-binding molecules. PCs are enzymatically synthesized peptides, whereas MTs are gene-encoded polypeptides. Several analytical methods have been used to analyze PCs, MTs and complexes of metal in different studies. Today, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF MS) is renowned for its extreme ease of operation and requirement of inexpensive matrices for preparation of sample; more importantly, the instrumentation is capable to be fully automated. In this study, the optimal condition for the characterization of PC2 and Cd-PC2 complex by MALDI-TOF MS was determined. The human MT2A and MT3 genes were expressed in heterologous organisms (Escherichia coli) by cloning. Further, MT2 protein was isolated from rabbit liver. MTs were purified by fast protein liquid chromatography (FPLC). The present study demonstrates analytical approachesof employing MALDI-TOF MS for characterization MTs. Other electrochemical methods were used for confirmation of thiols complexes with metal. Moreover, easy-touse instruments for MTs isolation, coupled with simple analytical detection method in fully automatic mode, providing prototype for the construction of sensor was designed

Keywords

fytochelatin, metalothionein, MALDI-TOF, těžké kovy, homeostáze kovů, rakovina

Keywords

Phytochelatin, metallothionein, heavy metal, MALDI-TOF, metal homeostasis, cancer

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 7. 2016

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. René Kizek, Ph.D.

Mendel University in Brno

Faculty of Agronomy

Doctoral programme / field:
Chemistry / Agricultural Chemistry