Expresní profil vybraných kandidátních molekul u pacientů s endoprotézou kyčle

Bc. Veronika KRÁLÍKOVÁ

Diplomová práce

Expression profile of selected candidate molecules in patients with total hip arthroplasty

Anotace:

Těžká poškození kyčelního nebo kolenního kloubu mohou být řešena operačně, pomocí totální endoprotézy (TEP). Komplikací těchto léčebných postupů však často bývá periprotetická osteolýza, která je způsobena částečkami uvolňovanými z povrchu protéz. Částice spouští imunitní reakci: dochází k zánětlivé reakci a zvýšené osteoklastogenezi. Ukazuje se však, že někteří pacienti jsou vůči osteolýze vnímavější. Cílem této práce bylo studovat využitelnost kultivací periferních buněk k predikci osteolýzy u pacientů s TEP. Sledovali jsme proto proteinovou expresi vybraných kandidátních molekul u periferních mononukleárních buněk (PBMC) po stimulaci prozánětlivým lipopolysacharidem (LPS), které byly získány u pacientů s totální endoprotézou kyčle. Skupina pacientů (n=32) byla dále rozdělena dle životnosti endoprotézy na pacienty bez komplikací a pacienty s nutností reoperace z důvodu osteolýzy. Kandidátní molekuly (cytokiny, jejich receptory a další regulační molekuly) byly vybrány na základě asociace genových polymorfismů s vývojem onemocnění popsané v literatuře a dle výsledků vlastních genetických analýz Laboratoře imunogenomiky a imunoproteomiky. Proteinové koncentrace byly měřeny v získaných supernatantech a sérech pomocí Luminex technologie. Při studiu proteinových expresních profilů cytokinů v supernatantech, odebraných po kultivaci PBMC buněk pacientů s totální endoprotézou kyčle, jsme pozorovali zvýšenou expresi cytokinů interleukinu (IL) 2, interleukinu (IL) 5, interferonu gamma (IFN-?) a vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) u pacientů se závažnou osteolýzou v porovnání se skupinou pacientů s mírnou osteolýzou. Dále jsme pak pozorovali signifikantní rozdíly v expresi cytokinů IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), tumor nekrotizující faktor ? (TNF-?) a IFN-? při porovnání skupin pacientů s běžným genotypem TNF -238 GG a závažnou nebo mírnou osteolýzou. U pacientů ? nosičů vzácné TNF -238*A alely se závažnou osteolýzou byla pozorována zvýšená exprese VEGF v porovnání s nenosiči této alely se závažnou i mírnou osteolýzou, což naznačuje, že k rozvoji periprotetické osteolýzy mohou přispívat i jiné než zánětlivé molekuly, a mohou být tedy aktivovány i jiné regulační dráhy. V sérech odebraných pacientům s totální endoprotézou jsme detekovali pouze cytokiny IL-6, IL-8, TNF-? a VEGF, z nichž pouze u cytokinu IL-6 jsme pozorovali rozdíly v expresi mezi jednotlivými skupinami pacientů. Naše výsledky prokázaly změny v proteinovém expresním profilu cytokinů po stimulaci PBMC prozánětlivým LPS u pacientů s osteolýzou ve srovnání s pacienty bez známek osteolýzy. Potvrdili jsme také vliv genotypu TNF -238 na expresní profil cytokinů u pacientů se závažnou osteolýzou. Naše nálezy tedy podporují teorii využitelnosti kultivací buněk izolovaných z periferní krve pro predikci komplikací pacientů s TEP.

Abstract:

Severe hip- or knee-joint damages may be treated surgically, with total endoprosthesis. These medical procedures are, however, quite often complicated by periprosthetic osteolysis, which is caused by particles released from the surface of the prosthesis. The particles trigger the immune response characteristic by the inflammatory reaction and increased osteoclastogenesis. However, it appears that some patients are more susceptible to osteolysis. The aim of this work was to study the usefulness of culturing of peripheral cells for the prediction of osteolysis in patients with total hip arthroplasty (THA). We therefore investigated the protein expression of selected candidate molecules in peripheral mononuclear cells (PBMC) after stimulation with proinflamatory lipopolysaccharide (LPS); cells were obtained in patients with total hip arthroplasty. The group of 32 patients was divided according to the lifetime of the prosthesis and in groups of patients without complications and those in need of reoperation because of osteolysis. Candidate molecules (cytokines, their receptors and other regulatory molecules) were chosen on the basis of the association of gene polymorphisms with the osteolysis described in the literature and own results of genetic analysis executed in the Laboratory of immunogenomics and proteomics. Protein concentrations were measured in obtained supernatants and sera using Luminex technology. When studying protein expression profiles of cytokines in the supernatants collected after cultivation of PBMC cells of patients with total hip arthroplasty, we observed increased expression of cytokines interleukin (IL) 2, interleukin (IL) 5, interferon gamma (IFN-g) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in patients with severe osteolysis compared with a group of patients with mild osteolysis. We also observed significant differences in the expression of cytokines IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor-a (TNF-a) and INF-g when comparing groups of patients with common TNF-238 GG genotype and severe or mild osteolysis. For patients - carriers of rare TNF-238*A allele with severe osteolysis increased expression of VEGF was observed when compared with non carriers of this allele with severe and moderate osteolysis, suggesting that the development of periprosthetic osteolysis may also be influenced by others than inflammatory molecules and may therefore be activated by other regulatory pathways. In serum samples in patients with total endoprosthesis, we detected only the cytokines IL-6, IL-8, TNF-a and VEGF, of which only for IL-6 we observed differences in expression between groups of patients. Our results showed changes in protein expression profiles of cytokines after stimulation of PBMC with proinflammatory LPS in patients with severe osteolysis compared with patients with mild osteolysis. We confirmed the effect of TNF-238 genotype on the expression profile of cytokines in patients with severe osteolysis. Our findings therefore support the theory of usability of cultivations of cells isolated from peripheral blood for the prediction of complications in patients with TEP.

Klíčová slova

totální endoprotéza kyčle, osteolýza, aseptické uvolnění, cytokiny, jednonukleotidové polymorfismy

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 8. 2011

Zveřejnit od: 15. 8. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Eva Kriegová, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Zoologie