Buněčné modely využitelné ke studiu patofyzilogie cystické fibrózy

Mgr. Martin ONDRA

Disertační práce

Cell Models to Study Pathophysiology of Cystic Fibrosis

Anotace:

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) je membránový protein, který funguje jako iontový kanál. Mutace, které narušují jeho biosyntézu, transport nebo funkci, způsobují cystickou fibrózu (CF). V teoretické části je sepsán úvod do problematiky CF se specifickým zaměřením na dostupné systémy pro detekci funkce CFTR, či přímo CFTR proteinu a pro monitorování aktivity profesionálních fagocytů, které sehrávají významnou roli v zánětlivé reakci doprovázející toto onemocnění. První sekce experimentální části této disertační práce popisuje vývoj a validaci nového in vitro systému pro detekci CFTR proteinu. V tomto modelu je do 4. extracelulární smyčky endogenně exprimovaného CFTR (WT-CFTR) vložena HiBiT peptidová značka pomocí CRISPR/Cas9 editace genomu, která umožnuje detekci CFTR v plazmatické membráně živých buněk. Souhrnně, byla vytvořena a validována nová reportérová buněčná linie využitelná jako stavební blok pro vývoj unikátních buněčných CF modelů pomocí CRISPR zprostředkovaného vkládání mutací CFTR způsobujících CF. Navíc tento optimalizovaný design CRISPR/Cas9 zprostředkovaného vložení HiBiT značky může být dále použit pro značení mutovaného CFTR v mnoha dalších buněčných liniích. V druhé části je popsán vývoj a validace nové metody vhodné k monitoringu fagocytární aktivity makrofágů zprostředkované manózovým receptorem CD206 (MR), jehož exprese bývá často snížena u CF pacientů. Princip této inovativní metody je založen na detekci internalizace fluorescenčních nanodiamantů (FND) se speciální povrchovou architekturou nesoucích polyvalentní manózu. In vitro experimenty prokázaly signifikantní zvýšení internalizace manozylovaných FND při srovnání s nemanozylovanými FND, přičemž u obou částic nebyla pozorována žádná významná toxicita. Specifické zapojení MR bylo potvrzeno blokací MR mananem a anti-MR protilátkou. Závěrem je důležité zdůraznit využitelnost nově vyvinutých inovativních metod a modelových systémů pro lepší porozumění procesů při průběhu CF, nebo i k objevení nových modulátorů CFTR, případně látek potlačujících zánět.

Abstract:

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a membrane protein that functions as an ion channel. Mutations that disrupt its biosynthesis, trafficking, or function cause cystic fibrosis (CF). The theoretical part provides an introduction to CF with a specific focus on available systems for detection of CFTR function or CFTR protein, and for monitoring the activity of professional phagocytes, which play a significant role in the inflammation accompanying this disease. The first section of the experimental part of this thesis describes the development and validation of a new in vitro system for CFTR protein detection. In this model, a HiBiT tag is inserted into the 4th extracellular loop of endogenously expressed CFTR (WT-CFTR) using CRISPR/Cas9 genome editing to enable the detection of CFTR in the plasma membrane of live cells. In summary, a novel reporter cell line has been established and validated with the potential to be used as a building block for the development of unique CF cell models using CRISPR-mediated insertion of CFTR-causing mutations. In addition, this optimized CRISPR/Cas9 mediated HiBiT tag insertion design can be further used to label mutant CFTR in diverse cell lines. The second part describes the development and validation of a new method suitable for monitoring macrophage phagocytic activity mediated by the mannose receptor (MR) CD206, whose expression is often reduced in CF patients. The principle of this innovative method is based on the detection of internalization of fluorescent nanodiamonds (FNDs) with a special surface architecture displaying polyvalent mannose. In vitro experiments showed a significant increase in the internalization of mannosylated FNDs when compared to non-mannosylated FNDs, while at the same time no significant toxicity was observed for both particles. The specific involvement of MR was confirmed by blocking MR with mannan and anti-MR antibody. In conclusion, it is important to emphasize the utility of newly developed innovative methods and model systems for a better understanding of processes during CF progression, or even for the discovery of new CFTR modulators or substances suppressing inflammation.

Klíčová slova

CFTR, CRISPR/Cas9, cystická fibróza, HTS, HiBiT, manózový receptor, luminiscence, FND

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 1. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Pediatrie / Pediatrie