Genetické aspekty příjmu těžkých kovů u ječmene

Mgr. Martina KINTLOVÁ

Disertační práce

Genetic aspects of heavy metal uptake in barley

Anotace:

Ječmen setý (Hordeum vulgare L.) je jednoděložná rostlina z čeledi lipnicovitých (Poaceae), která je ve srovnání osevních ploch čtvrtou nejrozšířenější zemědělskou plodinou na světě. Za těžké kovy můžeme označit kovy s hustotou větší než 5 g/cm3, řada z nich je pro fungování rostlin nezbytná. Ovšem i tyto mikronutrienty jsou ve vyšších koncentracích pro rostliny toxické, obdobně jako těžké kovy, u nichž nebyl biologický význam zjištěn. Kovy jsou rostlinami přijímány především kořenovým systémem a v menší míře také skrze listy z atmosféry. Množství kovů v buňkách je striktně regulováno podle aktuálních potřeb rostliny. Tato regulace probíhá na transkripční úrovni, a to zejména transkripcí membránových transportérů. Za účelem ochrany rostliny vůči nadbytku kovů se v buňkách uplatňují detoxifikační mechanismy. Předkládaná práce je zaměřena na hledání nových kandidátních genů zapojených do metabolismu těžkých kovů, a to pomocí analýzy transkripčních profilů rostlin ječmene pěstovaných v podmínkách zvýšené koncentrace vybraných kovů, mědi, zinku, respektive kadmia. Porovnáním kontrolních rostlin a rostlin pěstovaných ve zvýšené koncentraci kovů byl stanoven specifický expresní profil ječmene ve vybraných stresových podmínkách. Nejvíce "upregulovaným" genem v důsledku působení kadmia byl gen HvPCR2 vyskytující se u ječmene v celkem pěti kopiích. Funkční analýza v kvasinkách zhodnotila roli jednotlivých kopií v detoxifikaci kadmia. Dále byl studován vliv působení těžkých kovů na buněčný cyklus buněk kořenového meristému s využitím fluorescenční barvy EdU (5-ethynyl-2-deoxyuridin) a následného třídění značených jader pomocí průtokové cytometrie. Bylo sledováno, k jakému poškození buněk pod vlivem těžkých kovů dochází a zda se míra tohoto poškození pro jednotlivé kovy liší. V neposlední řadě jsme se zabývali studiem jednotlivých reziduí transportéru HvIRT1 z hlediska určení role v transportu těžkých kovů a substrátové specifity. Vybrané mutantní varianty transportéru HvIRT1 byly exprimovány v kmenech Saccharomyces cerevisiae citlivých na konkrétní těžké kovy. Na základě výsledků komplementačních testů byla rozšířeno povědomí o důležitosti jednotlivých aminokyselinových reziduích transportéru HvIRT1. Tato doktorská práce se věnovala pochopení reakce ječmene na přítomnost vybraných těžkých kovů v prostředí s využitím metod molekulární biologie, bioinformatiky a pokročilé cytometrie.

Abstract:

Barley (Hordeum vulgare L.) is a monocotyledonous plant of the Poaceae family, which is the fourth most widespread agricultural crop in the world in regard to the sown area. Heavy metals can be defined as metals with a density higher than 5 g/cm3, many of them are essential for plants. However, even these micronutrients are toxic to plants at higher concentrations, similar to heavy metals for which no biological function has been identified. Plants absorb metals primarily through the root system and partially also through the leaves from the atmosphere. The amount of metals in the cells is strictly regulated depending on the current needs of the plant. This regulation takes place at the transcriptional level, in particular by the transcription of the membrane transporters. Detoxification mechanisms take place in cells to protect plants from excess metals. The presented work is focused on the search for new candidate genes involved in heavy metal metabolism, by analyzing the transcription profiles of barley plants grown in conditions of increased concentration of selected metals, copper, zinc and cadmium, respectively. The specific expression profile of barley under selected stress conditions was determined by comparing control plants and plants grown in increased metal concentrations. The most upregulated gene in elevated cadmium concentration was the HvPCR2 gene, which occurs in barley in a total of five copies. Functional analysis in yeast evaluated the role of individual copies in cadmium detoxification. Furthermore, the effect of heavy metals on the cell cycle of root meristem cells was studied using the fluorescent dye EdU (5-ethynyl-2-deoxyuridine) and subsequent sorting of labeled nuclei by flow cytometry. The extent of damage of cells under the influence of heavy metals was elucidated as well as the degree of this damage in case of individual metals. Finally, we focused on the analysis of individual residues of the HvIRT1 transporter in terms of determining the role in heavy metal transport and substrate specificity. Selected mutant variants of the HvIRT1 transporter were expressed in Saccharomyces cerevisiae strains sensitive to specific heavy metals. Based on the results of complementation assays, awareness of the importance of individual amino acid residues of the HvIRT1 transporter was raised. This doctoral thesis deals with the understanding of the response of barley to the presence of selected heavy metals in the environment using the methods of molecular biology, bioinformatics and advanced cytometry.

Klíčová slova

Hordeum vulgare, těžké kovy, měď, zinek, kadmium, abiotický stres, transkriptom, sekvenování RNA, mRNA-seq, buněčný cyklus

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 24. 2. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Roman Hobza, Ph.D., RNDr. Roman Hobza, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie