Identifikace genů u vybraných enzymů metabolismu sirných látek bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans

Bc. Jiří Kučera, Ph.D.

Diplomová práce

Anotace:

Hlavním zdrojem energie chemolithoautotrofní bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans je oxidace redukovaných sirných sloučenin, elementární síry a nerozpustných sulfidů těžkých kovů, čehož se využívá v biohydrometalurgii. Bohužel má tento děj také negativní vliv na životní prostředí, jelikož metabolickou aktivitou této bakterie dochází k uvolňování kyseliny sírové do okolí, jež je spojeno s migrací těžkých kovů do roztoku. Dalším negativním aspektem metabolických aktivit této bakterie je proces biokoroze, což má za následek znehodnocování stavebních materiálů a hmot. Jelikož je dnes již známá nukleotidová sekvence genomu této bakterie, je žádoucí identifikovat proteiny, jež jsou hlavními činiteli metabolických procesů v buňce. Identifikace proteinů z celkového cytosolu je velmi náročná a neúčinná. Z tohoto důvodu byla pro vybranou skupinu enzymů metabolismu síry zvolena separace pomocí afinitních nosičů s vhodně zvolenými imobilizovanými ligandy, s následnou purifikací, získání aminokyselinové sekvence a detekce genů v celkovém genomu. Byla provedena prozatímní optimalizace desintegrace buněčných membrán bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans pro separaci cytosolových proteinů. Dále byly připraveny afinitní nosiče s imobilizovaným thiosulfátem, cytochromem c, glutathionem a směsi polythionanů se sírou. Pomocí afinitní chromatografie, případně vsádkovou metodou využívající afinitní interakce, byly izolovány proteiny a následně purifikovány gelovou permeační chromatografií a elektroforézou v přítomnosti SDS. Díky hmotnostní spektrometrii byly identifikovány proteiny: i) fosfátový transportní systém typu ABC izolovaný na nosiči s imobilizovaným thiosulfátem a také cytochromem c, ii) protein vázající sulfát/molybdenát izolovaný na nosiči s imobilizovaným cytochromem c, a rovněž glutathionem vázaného přes karboxylovou skupinu sorbentu, iii) proteinový prekurzor s rhodanasovou doménou izolovaný na nosiči s imobilizovaným cytochromem c. Dvourozměrnou elektroforézou byly potvrzeny rozdíly v expresi u vybraných proteinů v závislosti na zdroji energie při růstu bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans. Zjistilo se, že protein vázající sulfát/molybdenát a fosfátový transportní protein typu ABC patří mezi proteiny s velmi výrazným nárůstem při kultivaci na síře. Bioinformatickou analýzou byly předpovězeny některé vlastnosti identifikovaných proteinů.

Abstract:

Acidithiobacillus ferrooxidans is an acidophilic, chemolithoautotrophic bacterium that obtains its energy from the oxidation of ferrous iron, elemental sulfur, or partially oxidized sulfur compounds. The ability of this and other microorganisms present in its habitat to solubilize metal sulfides play an important role in biohydrometallurgy as well as in the environment. In the present of known nucleotide sequence of genom in bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans is important to identify proteins, which are the main agents of metabolic process in cell. The identification of proteins from total cytosol is very demanding and ineffective, due to an affinity chromatography with properly selected immobilized ligands was used for separation of proteins include in sulfur metabolism. It has been determined optimal conditions of cell membrane disintegration for separation of cytosolic proteins in bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. As immobilized ligands for affinity separation were prepared thiosulfate, cytochrom c, glutathion and mixture of sulfur with polythionates. Further gel permeation chromatography and one dimensional gel electrophoresis were used for purification of separated proteins by affinity chromatography. Moreover two dimensional electrophoresis was utilized to determine levels of protein synthesis in dependence on growth factors. As a tool for identification of proteins served mass spectrometry followed by bioinformatic analysis. Three proteins were identified: i) ABC-type phosphate transport system isolated on immobilized thiosulfate and also on immobilized cytochrom c, ii) sulfate/molybdate binding protein isolated on immobilized cytochrom c and also glutathion immobilized via carboxyl group of matrix, iii) rhodanase like precursor protein isolated on immobilized cytochrom c. Two dimensional electrophoresis showed the synthesis levels of ABC-type phosphate transport system and sulfate/molybdate binding protein increased distinctively during growth of Acidithiobacillus ferrooxidans on sulfur. Some features of identified proteins were predicted by bioinformatic analysis.

Klíčová slova

Acidithiobacillus ferrooxidans, gen, genom, ORF, protein, proteom, imobilizace ligandu, thiosulfát, cytochrom c, glutathion, polythionany, síra, afinitní chromatografie, vsádková metoda, gelová permeační chromatografie, PAGE-SDS, hmotnostní spektrometrie, MALDI-MS, identifikace proteinu, bioinformatická analýza, sulfate/molybdate binding protein, ABC-type phosphate transport system, rhodanase like precursor protein

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 5. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 23. 5. 2006
• Vedoucí: doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Chemie / Biochemie