Nové metody pro dvourozměrné separace složitých biologických vzorků

Bc. David Viktorín

Diplomová práce

New methods for two-dimensional separations of complex biological samples

Anotace:

Dosáhnout účinné separace složitých biologických vzorků pouze jednou separační technikou je velmi těžké. Z toho důvodu se v poslední době vyvíjí řada multidimenzionálních metod založených na separaci dle více než jedné fyzikálně-chemické vlastnosti vzorku. V této práci byl vyvinut jednoduchý 2D offline systém spojující kapilární izoelektrickou fokusaci s kapalinovou chromatografií na reverzní fázi. V první dimenzi byl vzorek rozdělen dle izoelektrického bodu do několika frakcí. Každá frakce pak byla separována v druhém rozměru dle rozdílů v hydrofobicitě. Tyto dva separační mechanismy jsou vůči sobě zcela orthogonální, což zajišťuje zvýšení separační účinnosti. Sbírání frakcí z prvního rozměru bylo umožněno konstrukcí membránového článku přímo na separační kapiláře. Konstrukce článku obnášela vytvoření praskliny na kapiláře, která byla následně potažena acetát celulózovou membránou. 2D-cIEF-RPLC systém byl pak úspěšně testován na vzorku triptického digestu BSA s využitím UV a LIF detekce.

Abstract:

Efficient separation of complex biological samples is very hard to achieve by only one separation technique. Thus, many multidimensional methods based on separation by multiple physically-chemical properties are being developed in recent time. In this thesis 2D offline system coupling capillary isoelectric focusing with reverse-phase liquid chromatography was developed. In the first dimension the sample mixture was resolved according to its pI to several fractions. Each fraction was further resolved by differences in hydrophobicity in second dimension. These separation mechanisms are completely orthogonal to each other so efficiency increase can be achieved. Collection of individual fractions was allowed by construction of membrane interface directly on the separation capillary. Interface was created by making on-column fracture which was coated by acetate-cellulose membrane. The 2D-cIEF-RPLC system was successfully tested with triptic digest of BSA as a sample using UV and LIF detection.

Klíčová slova

cIEF, RPLC, multidimenzionální separace, peptidy, proteiny izoelektrická fokusace, kapalinová chromatografie, acetát celulóza, hydroxypropylcelulóza, membránový článek

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2012
• Vedoucí: Ing. Dana Moravcová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie