Mass Spectrometry Based Metabolomics and Lipidomics

Darshak Chandulal Gadara, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Metabolity jsou konečnými produkty biologických reakcí a přímo korespondují s genotypem a fenotypem organismu. Analýza metabolomů má obrovský praktický význam v klinické diagnostice, stejně jako v mnoha dalších odvětvích vědy. Hmotnostní spektrometrie je v současnosti metodou volby v metabolomické analýze vzhledem k vysoké citlivosti, specific-itě, univerzálnosti a jednoduché úpravě vzorků. Metabolity mají velmi rozdílné fyzikálně-chemické vlastnosti, proto žádná analytická metoda nebo platforma není schopna zachytit kompletní metabolom. Například lipidy, přestože jsou podtřídou metabolomu, jsou studo-vány v rámci lipidomiky, neboť vyžadují odlišné strategie úpravy vzorků, výběru analytické metody a zpracování dat. Primárním cílem této práce je definovat moderní pracovní postupy v metabolomice a lipidomice a předvést jejich použití na relevantních klinických vzorcích nebo in vitro buněčném modelu. Prvním cílem práce (studie I) bylo vyvinout systematický pracovní postup zpracování dat pro necílenou metabolomiku. Metabolomika založená na hmotnostní spektrometrii generuje nepřeberné množství signálů v rámci jediné analýzy. Avšak více než 85 % zjištěných znaků je zpravidla falešně pozitivních v důsledku nedostatečné eliminace chimérických signálů a chemického šumu, které jsou irelevantní pro interpretaci biologických a klinických dat. Zpracování dat je považováno za kritický bod při odhalování translačního potenciálu v metabolomice. Popisujeme systematický pracovní postup pro přesnější zpracování explora-tivních metabolomických dat a redukci falešně pozitivních výsledků. Nově vyvinutý postup zpracování dat explorativní metabolomiky účinně odstraňuje falešně pozitivní výsledky způsobené chemickým šumem a chimérními signály použité analytické metody. Snížili jsme počet předběžně identifikovaných metabolitů o 88 % z původních 6940 identifikovaných pomocí XCMS na 839 pro snazší statistickou analýzu a interpretaci dat. Pracovní jsme ap-likovali ve studii na pacientech s běžnou variabilní imunodeficiencí (CVID) a kontrolách (studie II). Ve vzorcích stolice jsme zjistili snížené hladiny osmi identifikovaných metabo-litů, které odlišovaly CVID pacienty od kontrol. Tyto metabolity by mohly představovat nepřímé markery onemocnění, které mohou mít diagnostický a prognostický potenciál, zejména pro střevní komplikace spojené s CVID. Druhým cílem práce (studie III) bylo vyvinout pracovní postup mikroprůtokové lipidomiky (µLC-MS/MS) pro vysokopropustné a citlivé in vitro stanovení metabolismu lipidů. V poslední době se mikroprůtoková kapalinová chromatografie propojená s hmotnostní spek-trometrií (µLC-MS/MS) používá stále častěji pro vysokopropustné profilování biologických vzorků, protože představuje optimální kompromis mezi citlivostí a reprodukovatelností. Její použití v oblasti lipidomiky je však zatím velmi omezené. Proto jsme optimalizovali metodu µLC-MS/MS s kolonou o rozměrech 1 mm × 100 mm ve spojení s hmotnostním spektrome-trem s trojitým kvadrupólem, abychom vyvinuly citlivou, vysokopropustnou a robustní lip-idomickou analýzu. Ve srovnání s konvenční lipidomickou metodou jsme dosáhli ~3,7násobného zvýšení odezvy, což umožňuje kvantifikaci 351 druhů lipidů v cerebralním organoidu (CO), odvozeného z iPSC, během 15minutové LC-MS analýzy. Postupně jsme analyzovali 303 vzorků po dobu ~75 hodin, abychom prokázali robustnost a reprodukovate-lnost mikroprůtokové separace. Protokol byl aplikován na lipidové extrakty z APOE 3/3 a APOE 4/4 fenotypu CO (n=10 biologických replikátů) (studie IV). Naše výsledky odhalují aberace metabolism lipidů v APOE 4/4 fenotypu, včetně změn v metabolismu cholesterolu a sfingolipidů, které jsou pravděpodobně

Abstract:

relevantní pro patofyziologii Alzheimerovy choroby. Zajímavé je, že APOE 4/4 CO vykazuje zhoršené zabudování polynenasycených (4 a více dvojných vazeb) mastných kyselin do cholesterylesterů a fosfolipidů. Aplikace platformy pro mikroprůtokovou lipidomiku byla rozšířena o analýzy jednotlivého 3D-hepatosferoidního lipidomu a využita k charakterizaci profilu jaterního lipidomu po opako-vané expozici 2-etylhexyldifenylfosfátu (EHDPP) (studie V). Tato studie přináší nové poz-natky o účincích EHDPP narušujících lipidový metabolismus v kultuře lidských jaterních buněk.

Abstract:

Metabolites are the endpoint of biological reactions, accounting for the organism's genotype and phenotype. Therefore, a tremendous effort in measuring metabolomes in clinical diag-nosis and other scientific industries. Mass spectrometry has been at the center stage in metabolomics analysis because of its high sensitivity, specificity, versatility, and minimal sample preparation. Metabolites are highly diverse in their physicochemical nature. Thus, a single analytical method or platform cannot analyze the complete metabolome. For exam-ple, lipids, a subclass of the metabolome, are pursued as independent omics as they demand different strategies during the sample preparation, methods, and data processing. The thesis's primary objective is to establish state-of-the-art metabolomics and lipidomics workflows and demonstrate the application to relevant clinical samples or in vitro cell culture. The first objective of the thesis (study I) was to develop a systematic data processing work-flow for untargeted metabolomics. Mass spectrometry-based metabolomics generate a plethora of features per single analysis. However, >85% of detected features are typically false positives due to inefficient elimination of chimeric signals and chemical noise not rel-evant for biological and clinical data interpretation. The data processing is considered a bot-tleneck to unraveling the translational potential in metabolomics. We describe a systematic workflow to refine exploratory metabolomics data and reduce reported false positives. Our experimental metabolomics data processing workflow effectively removes false positives generated by the chemical background and chimeric signals inherent to analytical tech-niques. We reduced the number of tentatively identified metabolites by 88%, from initially detected 6940 features in XCMS to 839 tentative identifications and streamlined consequent statistical analysis and data interpretation. We applied the feature filtering workflow in a case/control study (study II) exploring common variable immunodeficiency (CVID). We reported decreased stool levels of eight metabolites, which clearly distinguish between CVID patients and controls and could represent indirect disease markers with diagnostic and prognostic potential, mainly for intestinal complications of CVID. The second objective of the thesis (study III) is to develop a microflow lipidomics workflow for high-throughput in vitro assays to explore lipid metabolism. Recently, microflow liquid chromatography interfaced with mass spectrometry (µLC-MS/MS) has been applied to the high-throughput profiling of biological samples and has proven an optimal trade-off between sensitivity and robustness. However, the application of µLC-MS/MS is very limited in lip-idomics. We optimized the µLC-MS/MS method with a 1 mm i.d. × 100 mm column cou-pled to a triple quadrupole mass spectrometer to establish sensitive, high-throughput, robust single-shot lipidomics workflow. We achieve a ~3.7-fold increase in response compared to the conventional lipidomics method, which quantifies 351 lipid species from a single iPSC-derived cerebral organoid (CO) during 15 min LC-MS analysis. Consecutively, we injected 303 samples over ~75 hours to prove the robustness and reproducibility of microflow separa-tion. As a proof of concept, lipidomics analysis was performed for the lipid extract of APOE 3/3 and APOE 4/4 (n=10 biological replicates) CO samples (study IV). Our results reveal that the APOE 4/4 phenotype causes lipid perturbations, including altered cholesterol and sphingolipid metabolism in a 3D neural tissue model, likely relevant to the pathophysiology of Alzheimer’s disease. Interestingly, APOE 4/4 CO shows compromised incorporation of poly unsaturated (4 or more double bond) fatty acids in cholesteryl aster and phospholipids. The application of the microflow lipidomics platform was extended to perform a single 3D-hepatosheroid lipidome and employed to characterize the he

Abstract:

patic lipidome profile after repeated exposure to 2-Ethylhexyldiphenyl Phosphate (EHDPP) (study V). This study brings novel insights into the lipid metabolism disrupting effects of EHDPP in human liver cell culture.

Keywords

Metabolomics, Lipidomics, Metabolism, Data-Processing, Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, Biomarker

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 8. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 7. 10. 2022
• Supervisor: PharmDr. Zdeněk Spáčil, Ph.D.
• Reader: Pavel Kielkowski, PhD, doc. Ing. Tomáš Čajka, Ph.D., doc. RNDr. David Friedecký, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Environmental Health Sciences / Computational biology, bioinformatics and modelling