Studium aktivity restrikčních enzymů typuI

Eva Tomaštíková

Diplomová práce

Study of restriction enzymes type I. activity

Anotace:

Restrikčně-modifikační systémy typu I jsou enzymatické komplexy přítomné v mnoha bakteriálních druzích, kde slouží jako součást jejich obranného systému. Tyto enzymy se skládají ze tří různých podjednotek, HsdS, HsdM a HsdR. Rozpoznávají specifickou nemodifikovanou sekvenci na DNA. DNA je translokována skrze enzymový komplex pomocí energie získané z hydrolýzy ATP, zatímco enzym zůstává pevně vázán v rozpoznávacím místě. V momentě, kdy je translokace zastavena, dojde ke štěpení dvouvláknové DNA v nespecifickém místě vzdáleném od rozpoznávací sekvence. Pro translokační a endonukleázovou aktivitu má zásadní význam HsdR podjednotka, která se skládá z jedné endonukleázové, dvou helikázových a jedné helikální domény. První známá krystalová struktura HsdR podjednotky byla popsána u enzymu EcoR124I. Znalost této struktury mimo jiné odhaluje neobvyklé zapojení endonukleázové domény do vazby ATP, které je u helikáz vázáno výhradně helikázovými doménami. Tato vazba, které se účastní Lysin 220 na endonukleázové doméně, s největší pravděpodobností hraje důležitou roli ve spřažení translokační a restrikční aktivity. Biochemickými testy bylo zjištěno, že změna této vazby výrazně ovlivňuje endonukleázovou aktivitu při zachování plné ATPázové aktivity. Abychom zjistili všeobecnou platnost těchto poznatků byl, vzhledem k malé sekvenční podobnosti této oblasti mezi jednotlivými zástupci endonukleáz typu I, testován vliv mutace analogového lysinu na ATPázovou aktivitu u HsdR podjednotky enzymu EcoAI, restrikčního enzymu typu IB. Pro tyto testy byly použity mutanty s lysinem (kladný náboj) substituovaným aminokyselinami argininem (kladný náboj), alaninem (neutrální) a glutamovou kyselinu (záporný náboj). Bylo zjištěno, že u všech uvedených mutací je ATPázová aktivita zachovaná, stejně jako u enzymu EcoR124I (typ IC)

Abstract:

The type I restriction-modification systems are enzymatic complexes, which are present in several bacterial species. They are involved in the protection of bacteria against bacteriophage attack. These enzymes consist of three different subunits ? HsdS, HsdM and HsdR. They recognize an unmodified specific DNA sequence. The DNA is translocated through the stationary enzyme complex while tightly bound at the recognition site. Translocation relies on energy gained by hydrolysis of ATP. When translocation is stalled, DNA is cleaved in a nonspecific site far from the recognition sequence. The HsdR subunit which consists of one endonuclease, two helicase and one helical domain plays a major role in translocation and endonuclease activities. The first described crystal structure was the HsdR subunit of the EcoR124I. This structure unexpectedly revealed a contribution of the endonuclease domain to ATP binding, which is in helicases bound only by the two helicase domains. This contact through Lysine 220 residue is probably important for coupling endonuclease and translocase functions. Substitution of this contact does alter the endonuclease activity while retaining full ATPase activity. As the Lysine containing region is of low sequence similarity between different endonucleases, to support the general validity of this finding the influence of mutations of potential analogous lysine in the HsdR subunit of the enzyme EcoAI from IB family on the ATPase activity was tested. Mutants with lysine residua (positive) changed to arginine (positive), alanine (neutral) or glutamic acid (negative) were used. We found out that all of these mutations do retain full ATPase activity which is in agreement with the EcoR124I

Klíčová slova

restrikčně-modifikační systému typu I, EcoAI, HsdR podjednotka, translokační aktivita, ATPázová aktivita

Keywords

type I restriction-modification systems, EcoAI enzyme, HsdR subunit, restriction activity, ATPase activity

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2010
• Vedoucí: Eva Csefalvay
• Oponent: Katerina Hofbauerova

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie