Tranzientní produkce protilátky trastuzumab v rostlinách tabáku

Radek Vítek

Master's thesis

Transient production of trastuzumab antibodies in tobacco planst

Abstract:

Molekulární farmaření je biotechnologické odvětví, které využívá rostliny pro produkci farmaceutických proteinů. Díky tomu lze levně, rychle a bezpečně vyrobit velké množství potřebného biofarmaka. Jedním z nich je trastuzumab, monoklonální protilátka cílící na Her2 pozitivní karcinomy, nejčastěji prsu a žaludku. Pro potřeby mé diplomové práce byly pomocí metod genového inženýrství vytvořeny 2 typy vektorů, nereplikující se a replikující se (založené na rostlinných virech TMV a PVX). Ve výsledku však replikující se vektory neposkytly žádnou expresi, a i přes opakované pokusy se nepovedlo vyvolat stabilní expresi protilátky. Nereplikující vektory však s úspěchem poskytly vysokou expresi. Byly vytvořeny 3 pokusné varianty, kdy byla pomocí vakuové agroinfiltrace kvantifikována tranzientní exprese protilátky v rostlinách N. benthamiana WT, N. benthamiana HCPro a N. rustica. Ke kvantifikaci proteinů byla využita ELISA a naměřené hodnoty byly normalizovány na celkový rozpustný protein. V první části byly rostliny koinfiltrovány vektory pro expresi protilátky trastuzumab a GFP. Byla potvrzena korelace exprese GFP a trastuzumabu, kdy fluorescence GFP dosahovala nejvyšších hodnot 5 DPI a množství trastuzumabu bylo nejvyšší v rozmezí od 6.-7. DPI. GFP tak lze použít pro odhad optimální doby sklizně, kdy rozdíl mezi ním a trastuzumabem je 1-2 dny. Nejvyšší sklizeň biomasy poskytla N. rustica (průměrně 26,12 g na rostlinu), ale exprese trastuzumabu se v ní nepodařila. Oba genotypy N. benthamiana se ve sklizené biomase statisticky nelišily. U WT linie bylo průměrně sklizeno 9,30 g a HCPro průměrně 8,62 g. Ovšem transgenní linie HCPro poskytla průměrně 9,296 mg trastuzumabu na rostlinu, tedy mnohem větší výtěžek než WT linie s 2,782 mg na rostlinu. Nakonec se protilátku podařilo úspěšně vyizolovat a purifikovat pomocí afinitní chromatografie s proteinem G.

Abstract:

Molecular farming is a biotechnology field which enables the use of plants for the production of pharmaceutical proteins. This allows large quantities of the required biopharmaceutical to be produced quickly and at a low cost. One of these is trastuzumab, an antibody targeting Her2-positive carcinoma, most commonly breast and gastric ones. For the purpose of my thesis, 2 types of vectors, non-replicating and replicating (based on plant viruses TMV and PVX) were created using genetic engineering methods. However, in the result, the replicating vectors did not provide any expression, and despite repeated attempts, a stable expresion could not be provide. The non-replicating ones, however, successfully provided high expression. Three experimental variants were designed by using a vacuum agroinfiltration to ensure transient expression of the antibody in N. benthamiana WT, N. benthamiana HCPro and N. rustica plants. ELISA was used to quantify the proteins and the measured values were normalized to total soluble protein. In the first part, plants were co-infiltrated with vectors for trastuzumab and GFP. The correlation of GFP and trastuzumab expression was confirmed, with GFP fluorescence peaking at 5 DPI and trastuzumab levels peeking from 6.-7 DPI. Thus, GFP can be used to estimate the optimal harvest time, with a difference of 1-2 days compared to trastuzumab concentration. N. rustica provided the highest biomass harvest with an average of 26.12 g per plant but failed to express trastuzumab. The two genotypes of N. benthamiana were not statistically different in harvested biomass. The WT line yielded an average of 9.30 g and HCPro averaged at 8.62 g. However, the HCPro transgenic line gave an average of 9.296 mg of trastuzumab per plant, a much higher yield than the WT line with 2.782 mg per plant. Finally, the antibody was successfully isolated and purified by protein G affinity chromatography.

Keywords

trastuzumab, transientní exprese, monoklonální protilátky, agroinfiltrace, Nicotiana rustica, afinitní chromatografie, virové vektory, Nicotiana benthamiana, molekulární farmaření

Keywords

transient expression, Nicotiana benthamiana, trastuzumab, monoclonal antibodies, agroinfiltration, molecular pharming, Nicotiana rustica, affinity chromatography, viral vectors

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Vladimíra Sedláková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Biotechnology and Plant Breeding