Buněčné a molekulární mechanismy během vývoje zubů a kostí se zaměřením na funkce kaspáz

Mgr. Eva Švandová, Ph.D.

Doctoral thesis

Cellular and molecular mechanisms during tooth and bone development with focus on caspase functions

Anotácia:

Apoptotická eliminace buněk má zásadní význam během vývoje a udržování homeostázy mnohobuněčných organismů. Její funkce byly popsány také během vývojových procesů zubních i peridentálních struktur. Kaspázy byly primárně identifikovány jako klíčové enzymy apoptózy. Finální exekuční fázi apoptózy zajišťuje trojice kaspáz-3, -6, -7. Kaspáza-3 je považována za centrální a nejfrekventovanější molekulu tohoto mechanismu. V současnosti však byly popsány i její další role mimo apoptózu. Tato práce se zaměřuje na studium funkcí strukturně i funkčně podobné kaspázy-7 ve vývoji tvrdých tkání. Aktivace kaspázy-7 byla detekována v primárním sklovinném uzlu (PEK) myšího moláru a pozitivně korelovala s výskytem apoptotických buněk, podobně jako kaspáza-3. Na rozdíl od kaspázy-3 však kaspáza-7 nebyla pro apoptózu PEK klíčová. Mimo oblast PEK byla aktivace kaspázy-7 ve vývoji zubů pozorována během diferenciace odontoblastů a ameloblastů, a také v dalších neapoptotických buňkách. Myši postrádající kaspázu-7 navíc vykazovaly statisticky významné snížení objemu skloviny řezáků, ne však molárů, což pravděpodobně souvisí s odlišným charakterem obou typů zubů. Během studia molárů byla detekována aktivace kaspázy-7 také v okolní mandibulární kosti. Vzhledem k tomu, že se osifikační mechanismy vývoje intramembranózních a endochondrálních kostí odlišují, pozornost byla zaměřena na oba modely. V obou systémech byla aktivace kaspázy-7 přítomna již od časných stádií osteogeneze. Efekt deficience kaspázy-7 nebyl identický s dříve popsaným fenotypem myší postrádajících kaspázu-3 a projevoval se odlišně u obou typů osifikace. Intramembranózní model vykazoval snížení objemu kostní tkáně, hustota kostní tkáně byla však intaktní. Naopak endochondrální model vykazoval konstantní objem kosti, ale snížení hustoty kostní tkáně. Deficience kaspázy-7 způsobila pokles exprese významných osteogenních faktorů, které byly sledovány s využitím PCR Array. Přesný mechanismus zapojení kaspázy-7 do diferenciačních procesů však zatím není zcela jasný. V úvahu připadá štěpení pluripotentních markerů, které vede k aktivaci diferenciačních drah a následné specializaci buněk. Jednou z vhodných metod dalšího studia kaspáz se ukazuje analýza jejich aktivity na úrovni jedné buňky, která představuje vysoký potenciál pro přesné výstupy a zároveň snižuje nároky na množství biologického materiálu. Studium vícečetných funkcí kaspáz má význam z hlediska terapeutického využití u různých onemocnění a defektů tvrdých tkání, například při léčbě osteoporózy.

Abstract:

Apoptotic cell elimination has a great importance for development and homeostasis in multicellular organisms. Its functions have been described also in formation of dental and periodontal structures. Caspases were primarily identified as the crucial molecules of the apoptotic machinery. The final executioner phase is ensured by trio of caspases-3, -6, -7. Caspase-3 is considered to be the central molecule of this process. Recently, novel roles of this enzyme far from apoptosis also emerge. Based on the knowledge of caspase-3, this study focuses on functions of structurally and functionally similar caspase-7 in the development of hard tissues. Activation of caspase-7 was detected in the primary enamel knot (PEK) of the mouse molar and positively correlated with distribution of apoptotic cells similarly to caspase-3. Contrary to caspase-3, however, caspase-7 was not crucial for PEK apoptosis. Beyond PEK area, activation of caspase-7 was observed during differentiation of odontoblasts and ameloblasts and in other non-apoptotic cells. Moreover, caspase-7 deficient mice showed statistically significant decrease in the enamel volume of incisors but not in molars, which may result from different characters of both teeth. During examination of tooth regions of the jaw, activation of caspase-7 was observed also in the mandibular bone. Since mechanisms of osteogenic development in the intramembranous and endochondral ossification are different, our attention was paid to both models. Activation of caspase-7 was detected from early stages of osteogenesis in both systems. However, the effect of caspase-7 deficiency was not identical to the phenotype previously described in caspase-3 deficient mice and was manifested differently in both types of ossification. In the intramembranous model, the volume of bone was decreased and bone mineral density was intact. Whereas, in the endochondral development, the bone volume was constant and bone mineral density decreased. Caspase-7 deficiency resulted in decreased expression of important osteogenic factors examined by PCR Array. However, the exact mechanism of caspase-7 engagement in osteogenic differentiation is not completely clear so far. Possibly, the cleavage of pluripotent markers could lead to the activation of differentiation pathways and cell specialisation. One possibility for further investigation is detection of caspase activity during single cell analysis, which has a large potential for accurate outcomes and also decreases demands on biological material. The examination of these multiple functions of caspase may have an importance also for therapeutic approaches in treatment of distinct diseases and defects in hard tissues, such as osteoporosis.

Kľúčové slová

apoptóza, diferenciace, endochondrální, intramembranózní, osteogeneze, odontogeneze, apoptosis, differentiation, endochondral, intramembranous, osteogenesis, odontogenesis

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 9. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 11. 2014
• Vedúci: prof. RNDr. Eva Matalová, Ph.D.
• Oponent: doc. Mgr. Petr Beneš, Ph.D., prof. MUDr. Lydie Izakovičová Hollá, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology