Cooperative RNA-binding of poly(A)-independent termination factors

RNDr. Miroslav Brumovský, Ph.D.

Bachelor's thesis

Abstract:

Nrd1-komplex má klíčovou úlohu při terminaci transkripce nepolyadenylovaných RNA, mezi které patří například snRNA, snoRNA nebo kryptické nestabilní transkripty (CUTs). Proteiny Nrd1 a Nab3, které jsou součástí tohoto komplexu, spolu interagují a jsou schopné specificky vázat terminační elementy na nascentní RNA. Předpokládá se, že tato RNA-vazebná interakce je zprostředkovaná RNA-rozpoznávacími motivy obou proteinů. Bakalářská práce je zaměřena na expresi dvou různých konstruktů proteinu Nrd1 a stanovení jejich afinity ke specifickým sekvencím RNA. Exprese proteinů byla provedena v buňkách E. coli. Po vyzkoušení různých expresních podmínek (vektorů, druhů buněk, teploty a koncentrace IPTG) byl úspěšně exprimován jeden z žádaných konstruktů a purifikován společně s různými konstrukty proteinu Nab3. Vazebná afinita mezi získanými heterodimery a RNA terminačním elementem byla stanovena pomocí anizotropie fluorescence. Výsledkem práce je naměření vazebných afinit připravených Nrd1-Nab3 heterodimerů k RNA a jejich porovnání s hodnotami pro full-length heterodimer i jiné konstrukty.

Abstract:

The Nrd1 complex is a crucial element in transcription termination of non-polyadenylated RNAs, e. g. snRNAs, snoRNAs or cryptic unstable transcripts (CUTs). Two proteins, Nrd1 and Nab3, that are part of this complex, physically interact with each other. They can bind specifically to the termination elements in the nascent RNA. It is supposed that the RNA-binding is mediated via RNA-recognition motifs present in both proteins. The bachelor’s thesis is focused on the expression of two different constructs of Nrd1 protein and their binding studies to specific RNA sequences. Protein expression was performed in E. coli cells. After testing of various expression conditions (vectors, strains, temperature, IPTG concentration) one of the desired construct was expressed successfully and co-purified with different Nab3 protein constructs. The binding affinity between prepared heterodimers and the RNA termination element was studied by fluorescence anisotropy. The result of the thesis is the measurement of RNA-binding affinities of prepared Nrd1-Nab3 heterodimers and their comparison with values for the full-length heterodimer and other constructs.

Keywords

RNA-protein interaction, Nrd1, Nab3, yeast, transcription termination, non-coding RNA

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 14. 6. 2011
• Supervisor: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.
• Reader: Mgr. María Victoria Marini Palomeque, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry