Cielená mutagenéza génov MMK2 a MMK3 pomocou CRISPR/Cas9 a transformácia lucerny siatej (Medicago sativa L.)

Bc. Veronika ZELINKOVÁ

Diplomová práce

Targeted mutagenesis of MMK2 and MMK3 genes using CRISPR/Cas9 and transformation of alfalfa (Medicago sativa L.)

Anotace:

Abstrakt Mitogénom aktivované proteín kinázy (MAPK) sú enzýmy dôležité pre život eukaryotických buniek. Majú signalizačnú úlohu počas mnohých bunkových procesov, ale aj pri reakcii organizmov na rôzne podnety z okolia. Predkladaná diplomová práca je zameraná na Medicago MAPK 2 (MMK2) a Medicago MAPK 3 (MMK3) v poľnohospodársky významnej lucerne siatej (Medicago sativa L.). Tieto kinázy sa u lucerny podieľajú na signalizácii počas niektorých abiotických stresov a tiež v prítomnosti mikrobiálnych elicitorov. Okrem toho sa uvažuje o podiele týchto kináz na regulácii bunkového delenia. Prínosom pre štúdium MAPK u lucerny môže byť vyradenie génov MMK2 a MMK3 z funkcie. Pre cielenú mutagenézu týchto génov v tetraplodinej lucerne bola zvolená technológia multiplex CRISPR/Cas9 ("clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9"), teda systém zložený z úsekov prokaryotickej DNA, pozostávajúcich z krátkych palindromatických repetitívnych sekvencií pravidelne usporiadaných v klastroch a asociovaného proteínu Cas9. Tento multiplexný CRISPR/Cas9 systém je založený na simultánnej expresii viacerých navádzajúcich RNA zacielených súčasne na niekoľko miest v genóme organizmu. Expresia Cas9 je v jednom variante pripravených CRISPR-KO vektorov pod kontrolou konštitutívneho promótora, pričom druhý variant obsahuje chemicky-inducibilný promótor, ktorý môže eliminovať možné nežiaduce následky konštitutívnej nadexpresie Cas9. Vzhľadom na to, že tento inducibilný systém nebol ešte použitý u lucerny siatej, boli v rámci tejto diplomovej práce optimalizované podmienky pre jeho praktické využitie. Za účelom cielenej mutagenézy génov MMK2 a MMK3, boli CRISPR-KO vektory stabilne transformované do listových explantátov lucerny siatej. Pripravené transgénne línie môžu byť v budúcnosti využité pre ďalšie analýzy s cieľom vyhodnotiť úspešnosť cielenej mutagenézy génov MMK2 a MMK3.

Abstract:

Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are enzymes important for the life of eukaryotic cells. They have a signalling role in many cellular processes, but also in the response of organisms to various environmental stimuli. This thesis focuses on Medicago MAPK 2 (MMK2) and Medicago MAPK 3 (MMK3) in the agriculturally important crop alfalfa (Medicago sativa L.). These two kinases are involved in alfalfa cellular signaling to some abiotic stresses and also to the presence of microbial elicitors. In addition, the involvement of the kinases in the regulation of cell division is considered. The knockout of the MMK2 and MMK3 genes may be beneficial for the study of MAPKs in alfalfa. The multiplex CRISPR/Cas9 ("clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9") technology was chosen for targeted mutagenesis of these two genes in tetraploid alfalfa. It represents a system composed of sections of prokaryotic DNA consisting of short palindromic repeat sequences arranged regularly in clusters and the associated Cas9 protein. Such multiplex CRISPR/Cas9 system is based on the simultaneous expression of multiple guide RNAs simultaneously targeting several sites in the genome of an organism. Cas9 expression is under the control of a constitutive promoter in one variant of the prepared CRISPR-KO vectors, while the other variant contains a chemically-inducible promoter that can eliminate the possible undesirable consequences of constitutive overexpression of Cas9. Such inducible system has not yet been used in alfalfa so far, therefore conditions for its practical use were optimized in this thesis. For the purpose of targeted mutagenesis of MMK2 and MMK3 genes, CRISPR-KO vectors were stably transformed into alfalfa leaf explants. The transgenic alfalfa lines regenerated through somatic embryogenesis can be used for future analyses evaluating the success of targeted mutagenesis of MMK2 and MMK3 genes.

Klíčová slova

Medicago sativa, mitogénom aktivovaná proteín kináza 2 v Medicago, mitogénom aktivovaná proteín kináza 3 v Medicago, multiplex CRISPR/Cas9, chemicky-indukovateľná expresia.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 4. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie a genové inženýrství / Biotechnologie a genové inženýrství