MALDI-TOF MS v typizaci environmentálně a potravinářsky významných bakterií

Mgr. Andrea Vávrová, Ph.D.

Disertační práce

MALDI-TOF MS in typing of bacteria important in environment and food industry

Anotace:

Hmotnostní spektrometrie se již téměř tři desetiletí řadí mezi techniky, které pro analýzu mikroorganizmů poskytují specifické výstupy. Hmotnostní spektra jsou detailními fingrprinty analyzovaného vzorku, a to dokonce při nanomolové koncentraci analytu. Řada současných studií moderní se věnuje posouzení aplikovatelnosti a diskriminačních schopností techniky MALDI TOF MS (hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem) pro kategorizaci, diferenciaci, identifikaci a typizaci bakterií. Velkou výhodou MALDI-TOF MS v mikrobiologii je nízká pracnost, vysoká specifita a rychlost analýz, automatizovatelnost a komplementarita s jinými metodami, což jí zajišťuje čelní místo v postupech polyfázové taxonomie. Předložená dizertační práce je koncipována jako soubor komentovaných publikovaných prací již tištěných; poslední přiložená publikace je revidovanou verzí v recenzním řízení. Dizertační práce se zaměřila na aplikovatelnost MALDI-TOF MS pro polyfázovou taxonomii heterogenních bakteriálních zástupců environmentálně a potravinářsky významných bakterií. Analyzovány byly taxony, jejichž charakteristickou vlastností je značná diverzita druhového zastoupení a obtížná identifikace a typizace jednotlivých druhů a poddruhů. Jako příklady lze uvést rody Aeromonas, Pseudomonas, Lactobacillus či Bifidobacterium. Byla vyhodnocena aplikovatelnost komerčně dostupného identifikačního systému BioTyper (Bruker Daltonik) pro identifikaci izolátů Bifidobacterium spp. a Lactobacillus spp. ze vzorků střevní sliznice dětských pacientů a dále aeromonád včetně nově popsaných druhů. Bylo dokázáno, že charakter hmotnostního spektra a zastoupení referenčních kmenů v databázi významně ovlivňuje úspěšnost identifikace bakterií a pravděpodobnost falešně pozitivních identifikací. Obohacení standardní komerčně dostupné MALDI MS databáze referenčních spekter o hmotnostní spektra relevantních kmenů v případě MALDI MS profilů chudých na druhově specifické signály nevede ke zlepšení identifikačních výstupů metody (Vávrová a kol., 2014a). Byla testována reprodukovatelnost výstupů při změnách kultivačních podmínek a jejich vliv na rozlišování kmenů a identifikaci vybraných druhů komplexu Lactobacillus acidophilus. Komentovaná publikace Šedo a kol., (2012) potvrzuje fakt, že výsledné hmotnostní spektrum vykazuje pro identifikaci druhů rodu Lactobacillus konstantní hladinu signálů neovlivnitelnou podmínkami růstu kultury, ale pro typizaci jednotlivých kmenů tohoto rodu hrají podmínky kultivace významnou roli. Vliv typu média a délky kultivace na protein/peptidový profil se liší v závislosti na analyzovaném mikroorganizmu, přičemž diskriminační schopnosti metody jsou závislé na počtu robustních kmenově charakteristických signálů. Studie Vávrová a kol. (2014b) se pomocí MALDI MS zabývala identifikací obtížně kultivovatelných a identifikovatelných anaerobních kontaminant přítomných v procesu výroby piva. Cílem byla identifikace kontaminant nejen po jejich namnožení ve vhodných kultivačních médiích, ale i přímo ze vzorků biofilmů pivovarských stáčíren lahví, a to s různými postupy úpravy vzorků biofilmů. V tomto případě bylo pro úspěšnou identifikaci velké části izolovaných kmenů nutné rozšířit komerčně dostupnou databázi dalšími relevantními vstupy. Ve studiích Gomila a kol. (2011) a Kosina a kol. (2013a,b) byla posouzena přínosnost a aplikovatelnost techniky MALDI-TOF MS jakožto součásti polyfázové taxonomie při popisu nových druhů a poddruhů rodů Achromobacter a Pseudomonas. Izoláty jmenovaných rodů, které nejevily výsledky fenotypizačních či genotypizačních metod podobné žádnému z dříve popsaných druhů, byl

Anotace:

y i MALDI MS analýzami odlišeny na základě odlišného charakteru hmotnostních spekter.

Abstract:

Mass spectrometry has been representing for the last three decades a promising tool providing specific outputs in microorganismsˊ analysis. Mass spectra are detail imprints of the analyzed sample, even in the case of nanomols concentrations of analyte. Many of the up-to-date studies are concentrated on the topic of applicability and consideration of discriminatory power of MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) for categorization, differentiation, identification and typing of bacteria. The advantages of MALDI-TOF MS lean on a non-laborious and time saving approach, specific outputs, possibility of the method being automatized and its complementarity with other methods, thereby ensuring its top position among the methods of polyphasic taxonomy of microorganisms. Submitted dissertation thesis is conceived as a complex of commented studies that have been published, submitted and reviewed, or submitted and still being under revision. The topic of the dissertation thesis is applicability of MALDI-TOF MS in polyphasic taxonomy of heterogeneous bacteria from the environment and food-processing industry. The main characteristic of the analyzed genera is diversity of species, troublesome identification and typing of species and subspecies (Aeromonas, Pseudomonas, Lactobacillus or Bifidobacterium). With the coauthors, we have evaluated the applicability of commercially available BioTyper system (Bruker Daltonics) for aeromonads identification. We have proved that mass spectra character and presence of relevant reference mass spectra in the database affect the amount of correct identification outputs and the probability of false positive identifications. Any extension of the commercially available database for the case of species providing poor protein/peptide profiles does not improve the identification outputs (Vávrová et al. 2014a). We have tested the effect of culture conditions on reproducibility and strains profiling of particular species of Lactobacillus acidophilus group. The study Šedo et al. (2012) shows that culture conditions do not affect species identification, but could significantly affect profiling of strains. The type of microorganism and the presence of strainsˊ specific signals affect the discriminatory power of the method. The study Vávrová et al. (2014b) has focused on identification of anaerobic beer spoilage bacteria, present in biofilm of breweries. Alongside with the identification of bacterial members that are difficult to culture and to identify, we have tested the direct analysis of biofilm from brewery bottling halls. In case of mass spectra character of beer spoilage bacteria, there have been observed some successful identification outputs while enlarging the standard commercially available database. Gomila et al.. (2011), Kosina et al. (2013a, 2013b) studies show the applicability of MALDI-TOF MS as a part of polyphasic taxonomy approach in process of novel Achromobacter and Pseudomonas species and subspecies description.

Klíčová slova

Aeromonas, Achromobacter, Bifidobacterium, BioTyper, identifikace, Lactobacillus, MALDI-TOF MS, Megasphaera, polyfázová taxonomie, Pectinatus, Pseudomonas, Selenomonas, typizace kmenů

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 7. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 2. 9. 2014
• Vedoucí: RNDr. Ludmila Tvrzová, Ph.D.
• Oponent: prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D., Mgr. Eva Krejčí, Ph.D., RNDr. Milan Petráš, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Mikrobiologie