Testování nových promotorů v rajčeti a ječmeni pomocí lokalizace GFP

Tereza SLANINOVÁ

Master's thesis

Testing of new promoters in tomato and barley using GFP localization

Abstract:

Cytokininy jsou rostlinné hormony, které regulují množství fyziologických procesů, jako tolerance k stresu, vývoj prýtu a kořenů, či produkce květu a semen. Cytokindehydrogenasa (CKX; EC 1.5.99.12) je enzym, který katalyzuje ireverzibilní degradaci cytokininů (CK) v rostlinách. Snížení hladiny CK v transgenních rostlinách, které nadprodukují CKX vede k produkci mohutného kořenového systému, avšak negativně ovlivňuje vývoj nadzemní části rostlin. Použitím kořenově specifických promotorů pro řízení exprese CKX genů by bylo možné získat transgenní rostliny se zvětšeným kořenovým systémem, jejichž nadzemní část by zůstala nezměněná. Byl vyselektován nový potencionální kořenově specifický promotor (RSP), který byl použit pro řízení exprese HvCKX3-GFP fúzního genu v transgenních rostlinách. HvCKX3 gen má mutaci v doménové sekvenci, ve které je prolin zaměněn za histidin. Cílem této práce bylo zjistit, či tato mutace u HvCKX3 genu vede k tvorbě funkčního proteinu. Zároveň byl připraven druhý konstrukt pHvCKX3::HvCKX2.2-GFP, ve kterém byla exprese HvCKX2.2 genu řízena pHvCKX3 promotorem, který řídí nativní expresi HvCKX3 genu. Cílem bylo otestovat, zda exprese HvCKX2.2 genu vede také k tvorbě aktivního proteinu. Oba konstrukty, spolu s kontrolním konstruktem SU::GFP, byly nejprve testovány v rajčeti, kde byly transformovány pomocí A.rhizogenes. U RSP::HvCKX3-GFP transgenních kořenů rajčete byla pomocí PCR reakce na templát z genomové DNA potvrzena přítomnost transgenu. Exprese HvCKX3-GFP a transgenu byla potvrzená pomocí kvantitativní PCR a exprese GFP fúzního proteinu pomocí konfokální mikroskopie. Tímto konstruktem v A.rhizogenes byly dále transformovány kalusy ječmene, u kterého byly optimalizovány podmínky pro indukci tvorby "hairy roots". RSP::HvCKX3-GFP transgenní kalusy produkovaly kořeny, kde byla přítomnost transgenu potvrzena PCR z genomové DNA, exprese GFP fúzního proteinu byla potvrzena konfokální mikroskopií, avšak tyto kořeny nebyly schopné samostaného růstu. Dále byly konstruktem RSP::HvCKX3-GFP v A.tumefaciens natransformovány nezralé embrya ječmene a následně bylo získáno 9 nezávislých transgenních linií ječmene. Ve všech transgenních liniích byla potvrzena přítomnost transgenu pomocí kontrolní PCR. Exprese GFP genu byla naměřena v různých vývojových stádiích kořenu a listu, co naznačuje, že promotor neřídí expresi specificky v kořenech. Transgenní rostliny ječmene vytvářely mohutný kořenový systém v prvních týdnech vývoje, kde nadzemní část těchto rostlin zůstala bez větších změn ve srovnání s rostlinami divokého typu.

Abstract:

Cytokinins are plant hormones which regulate many physiological processes stress tolerance, shoot and root development, flowering and seed production. Cytokinin dehydrogenase (CKX; EC 1.5.99.12) is an enzyme that catalyses irreversible cytokinin (CK) degradation in the plants. Overexpression of CKX genes under the control of constitutive promoters in transgenic plants has positive effect on root production but negative effect on shoot development. When root-specific promoters for driving the expression of CKX genes are used, transgenic plants produced increased root system with unchanged shoot growth. We have selected a new potential root-specific promoter (RSP) to drive the expression of HvCKX3-GFP fused gene within transgenic plants. HvCKX3 gene has a mutation in a domain sequence, in which proline was changed for histidine. The goal of our work was to know if the mutation in HvCKX3 gene leads to a production of a functional protein. We prepared another construct pHvCKX3::HvCKX2.2-GFP in which the expression of HvCKX2.2 gene was controlled by promoter pHvCKX3 (it naturally controls the expression of HvCKX3 gene). We wanted to test if the expression of HvCKX2.2 gene leads to a production of a functional protein. Furthermore, we have prepared also another construct pHvCKX3::HvCKX2.2-GFP, where the HvCKX3 genes promoter was used for driving the expression of HvCKX2.2 gene. Both constructs in vector pGWB1 together with control construct SU::GFP were first transformed into tomato by A. rhizogenes, which induced production of tomatoes hairy roots. The presence of the transgene in tomatoes hairy roots was confirmed by PCR from genomic DNA and the expression of transgene was confirmed by qPCRand confocal microscopy. The same constructs in A.rhizogenes were used for transformation of barley calluses. We optimized conditions for induction of root growth from calli transformed with A. rhizogenes. The presence of the RSP::HvCKX3-GFP in transgenic barley roots and calli was confirmed by PCR and the expression of HvCKX3-GFP gene was confirmedby confocal microscopy. These transgenic barley roots were not able to growth independently and died together with transgenic calli few weeks after transfer on the selection medium. In addition RSP::HvCKX3-GFP construct in pBract209 was transformed into barley immature embryos using A. tumefaciens. Together 9 independent transgenic barley lines were prepared which contained target construct. The expression of GFP gene was detected in both roots and leaves of transgenic plants, which suggests the leakage unspecifity of the promoter activity. Transgenic barley plants produced bigger roots within first weeks after transfer to the soil, but the shoot development was not significantly changed, in comparison with WT plants.

Keywords

cytokininy, cytokinindehydrogenasa, Agrobacterium rhizogenes, hairy roots

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 4. 2014

Accessible from:: 30. 4. 2014

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Katarína Mrízová

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry