Kryokonzervace spermií volně žijících druhů zvířat

Alexandr Jestřáb

Bachelor's thesis

Cryopreservation of sperm cells of wildlife species

Abstract:

Kryokonzervace byla popsána jako metoda pro uchování spermií, vajíček nebo embryí pro jejich pozdější využití. Principem této metody je provedení postupného ochlazování až na teplotu -196°C s použitím kryoprotektiva, což je speciální kryokonzervační médium pro uchování životaschopnosti reprodukčních buněk v tekutém dusíku při velmi nízké teplotě tak, aby nedošlo k jejich destrukci. Cílem procesu kryokonzervace je zabránit tvorby ledových krystalů a dehydrataci buňky. V okamžiku, kdy se teplota blíží bodu mrazu, se žačínají tvořit mimo buňku (extracelulární prostor) ledové krystaly a vytvářet tak osmotickou nerovnováhu. Nerovnováha má za následek dehydrataci buněk. Následky způsobené dehydratací a krystalizací lze minimalizovat kontrolou rychlosti chlazení, používání kryoprotektivních látek, udržování vhodných skladovacích teplot a kontrolou rychlosti rozmrazení. Při metodě pomalého mrazení jsou buňky vloženy do vhodného mrazicího média, kde jsou ponechány různý časovy interval (záleží na samotném zvířeti) až do uplného proniknutí kryoprotektiv do buňky a poté chlazeny. Tvorba ledu nemusí nutně začít při dosažení bodu mrazu. Buňky podstupující kryokonzervaci musí odolat řadě velkých a náhlých teplotních změn. V nezmrzlé frakci čelí velmi vysoké koncentraci rozpuštěných látek, které mohou být toxická. Dehydratace a vysoká koncentrace solí zapřičiňují ztrátu stability v membránách nebo denaturaci proteinů.Jako vitrifikace se označuje proces vedoucí k přeměně z kapaliny na pevnou látku bez krystalizace. Vitrifikační metody zahrnují použití média, které má na začátku velmi vysokou hodnotu koncentrace rozpuštěných solí. Led se tedy nemůže tvořit v žádné části vzorku. Mnoho živočišných druhů je na pokraji vyhubení, nebo je silně ohroženo. Proto využíváme metody, prodlužující uchovávat genetický materiál, který umožňuje jejich reprodukci. Jako je kryokonzervace.Kryokonzervace spermatu je v současnosti již běžnou praxí.Podmínkou provedení kryokonzervace spermií je použití vhodné metody pro získání ejakulátu. Sběr spermatu pomocí umělé vagíny, je nejčastější technika používaná u domácích zvířat, zejména u skotu (Bhattacharya et al. 2009) a koní. Další možností získání ejakulátu je sběr postkoitálních spermií Tato metoda zachycuje pouze část vyprodukovaného celkového množství spermatu. Sperma může být odebráno přímo ze samičího reprodukčního traktu, může být také sbíráno pomocí vaginálního kondomu.Standartní sběrnou technikou u naprosté většiny divoce žijících druhů savců, za současného použití anestezie se stala metoda elektroejakulace. Zajímavou alternativou pro neinvazivní odběr spermatu je použití rektální manuální stimulace přídatných pohlavních žláz. Výhodou metody není nutností použití anestezié, která je těžko indikovatelná u volně žijících druhů zvířat.Mezi invazivní metody odběru ejakulátu je řazen odběr spermatu post mortem nebo po kastraci. Pro získání kvalitních spermií je velmi nejdůležité zkrátit čas mezi úhynem zvířete či kastrací a odběrem spermatu.Metodou používanou při získávání spermatu kohoutů je masážní technika v oblasti páteře. U plazů, podobně jako u ryb, je sperma nejčastěji odebíráno využitím techniky břišní masáže.

Abstract:

Cryopreservation has been described as a method for preserving sperm, ova or embryos for later use. The principle of this method is to perform gradual cooling down to -196 ° C using a cryoprotectant, which is a special cryopreservation medium for maintaining the viability of reproductive cells in liquid nitrogen at a very low temperature so that they are not destroyed.The aim of the cryopreservation process is to prevent the formation of ice crystals and dehydration of the cell. As the temperature approaches freezing, ice crystals begin to form outside the cell (extracellular space), creating an osmotic imbalance.Imbalance results in cell dehydration. The consequences of dehydration and crystallization can be minimized by controlling the cooling rate, using cryoprotectants, maintaining appropriate storage temperatures, and controlling the thawing rate.In the slow freezing method, the cells are placed in a suitable freezing medium, where they are left for a different time interval (depending on the animal itself) until the cryoprotectants completely penetrate the cell and then cooled. Ice formation does not necessarily start when the freezing point is reached.Cells undergoing cryopreservation must withstand a number of large and sudden temperature changes. In the unfrozen fraction, they face very high concentrations of solutes, which can be toxic. Dehydration and high salt concentrations cause loss of membrane stability or denaturation of proteins.Vitrification is the process of converting from a liquid to a solid without crystallization. Vitrification methods involve the use of a medium that initially has a very high concentration of dissolved salts. Thus, ice cannot form in any part of the sample.Many animal species are on the verge of extinction or are highly endangered. Therefore, we use methods that prolong the storage of genetic material that allows their reproduction. Such as cryopreservation.Cryopreservation of sperm is now a common practice.The condition for cryopreservation of sperm is the use of a suitable method for obtaining ejaculate. Sperm collection using an artificial vagina is the most common technique used in domestic animals, especially cattle (Bhattacharya et al. 2009) and horses. Another way to obtain ejaculate is to collect postcoital sperm. This method captures only a part of the total amount of sperm produced. Sperm can be collected directly from the female reproductive tract, it can also be collected using a vaginal condom.The method of electroejaculation has become the standard collection technique for the vast majority of wild mammal species, with the simultaneous use of anesthesia.An interesting alternative for non-invasive sperm collection is the use of rectal manual stimulation of the accessory gonads. The advantage of the method is not the need to use anesthesia, which is difficult to indicate in wild species.Invasive methods of ejaculate collection include post-mortem or post-castration sperm collection. To obtain quality sperm, it is very important to shorten the time between the death of the animal or castration and the collection of sperm.The method used in obtaining sperm from roosters is a massage technique in the area of the spine.In reptiles, similar to fish, semen is most often collected using the technique of abdominal massage.

Keywords

spermie, kryokonzervace, vitrifikace, volně žijící zvířata

Keywords

sperm, cryopreservation, vitrification, wild animals

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: MVDr. Romana Krejčířová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Agriculture, Horticulture and Rural Development / Animal Production