HILIC separace nukleových bází, nukleosidů a nukleotidů na kapilárních kolonách

Bc. Natálie Hochmanová

Master's thesis

HILIC separation of nucleobases, nucleosides and nucleotides using capillary columns

Abstract:

Chromatografie hydrofilních interakcí je jednou z modifikací vysokoúčinné kapalinové chromatografie a slouží k separaci vysoce hydrofilních a polárních látek, které nejsou dostatečně zadržovány v systémech s normálními nebo s obrácenými fázemi. Kombinuje polární stacionární fáze typické pro kapalinovou chromatografii na normální fázi a mobilní fáze s obsahem vodné složky podobně jako kapalinová chromatografie na obrácené fázi, které navíc obsahují vysoký podíl organického rozpouštědla. Diplomová práce se zabývá optimalizací podmínek pro separaci vybraných nukleových bází, nukleosidů a nukleotidů na dvou zwitteriontových náplňových kapilárních kolonách – komerční koloně ZIC®-HILIC a v laboratoři připravené koloně plněné kromasilovými částicemi modifikovanými 3-(trimethoxysilyl)propyl methakrylátem (γ-MAPS) a [2-(methakryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl) hydroxidem amonným (DMAPS). Důraz je kladen zejména na použité procento organického rozpouštědla (acetonitril) v mobilní fázi, volbu typu a koncentrace soli (octan a mravenčan amonný) a hodnotu pH mobilní fáze. Jako nejoptimálnější byla pro separaci nukleových bází a nukleosidů na obou zwitteriontových kolonách vyhodnocena mobilní fáze obsahující 90 % (v/v) acetonitrilu a 10 % (v/v) 100mM octanu amonného o pH = 4,5. Práce zahrnuje také optimalizaci separačních podmínek pro analýzu směsi nukleosidů a nukleotidů, které jsou součástí kojenecké výživy (reálný vzorek). Optimální složení mobilní fáze bylo 75 % (v/v) acetonitrilu a 25 % (v/v) 5mM mravenčanu amonného s 0,1% (v/v) přídavkem kyseliny mravenčí (pH = 3,11), což na koloně ZIC®-HILIC umožnilo provést analýzu deseti látek do 6 minut. V daném experimentálním uspořádání bylo dosaženo LOD 0,016 mg/ml pro nukleosidy a 0,1 mg/ml pro nukleotidy a LOQ 0,1 mg/ml pro nukleosidy a 0,25 mg/ml pro nukleotidy.

Abstract:

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography is a modification of High Performance Liquid Chromatography used for the separation of highly hydrophilic and polar substances that are not sufficiently retained in normal or reversed phase systems. This modification combines polar stationary phases typical for Normal-Phase Liquid Chromatography and aqueous mobile phases similar to Reversed-Phase Liquid Chromatography enriched with a high proportion of an organic solvent. The diploma thesis deals with the optimization of separation conditions for selected nucleobases, nucleosides and nucleotides using two zwitterionic packed capillary columns, namely a commercial ZIC®-HILIC column and a laboratory prepared column filled with Kromasil particles modified with 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (γ-MAPS)and [2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammonium hydroxide (DMAPS). The optimization is focused mainly on the concentration of the organic solvent (acetonitrile) in the mobile phase, the type (ammonium acetate and formate) and concentration of salt and the pH value of the mobile phase. For the separation of nucleobases and nucleosides on both zwitterionic columns, the mobile phase containing 90 % (v/v) acetonitrile and 10 % (v/v) 100mM ammonium acetate, pH = 4.5 was evaluated as the best choice. This thesis also includes the optimization of separation conditions for the determination of nucleosides and nucleotides in infant formula (real sample). For this purpose, the optimal composition of the mobile phase was 75 % (v/v) acetonitrile and 25 % (v/v) 5mM ammonium formate with 0.1% (v/v) formic acid (pH = 3.11), which allowed to perform an analysis of ten substances on ZIC®-HILIC column within 6 minutes. In a given experimental set-up, LOD for nucleosides was 0.016 mg/ml and for nucleotides 0.1 mg/ml, while LOQ for nucleosides was 0.1 mg/ml and for nucleotides 0.25 mg/ml.

Keywords

vysokoúčinná kapalinová chromatografie, chromatografie hydrofilních interakcí, kapilární kolona, zwitteriontová stacionární fáze, nukleové báze, nukleosidy, nukleotidy, HPLC, HILIC, High Performance Liquid Chromatography, Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, capillary column, zwitterionic stationary phase, nucleobases, nucleosides, nucleotides

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 8. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 9. 9. 2020
• Supervisor: Ing. Dana Moravcová, Ph.D.
• Reader: Ing. Jozef Šesták, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Bioanalytical Laboratory Diagnostics in Medicine - Bioanalytic / Bioanalytical Laboratory Diagnostics in Medicine - Bioanalyst