Prozánětlivé působení lipopolysacharidů sinicových vodních květů in vitro

Mgr. Veronika Skočková, Ph.D.

Doctoral thesis

Pro-inflammatory effects of cyanobacterial water bloom lipopolysaccharides in vitro

Abstract:

Sinicové vodní květy jsou celosvětovým ekologickým problémem a mezi bioaktivní látky, které produkují, patří i lipopolysacharidy (LPS). LPS pocházející z vodního květu jsou směsí LPS různých sinic a Gram negativních (G-) bakterií, které se vyskytují v prostředí sinicového květu. Člověk může být vystaven působení těchto LPS i při rekreačních aktivitách ve vodách kontaminovaných vodním květem. V takovém případě se do přímého kontaktu s LPS dostávají epitely, existuje však jen málo dokladů o reakci epitelů na LPS sinic a sinicových květů. O reakci kožního a střevního epitelu pak nejsou informace žádné. LPS byly izolovány ze sinicových květů a laboratorních sinicových kultur. Celkem byly studovány LPS z 23 vodních květů a čtyř rodů sinic kultivovaných v laboratorních podmínkách, jednalo se o rody často tvořící vodní květy (Aphanizomenon, Planktothrix, Dolichospermum a Microcystis). Použili jsme standardní i striktně axenickou kultivaci sinic, abychom se vyvarovali možného vlivu bakteriálních LPS na výslednou aktivitu. Prozánětlivý potenciál LPS jsme stanovili pomocí komerčního testu PyroGeneTM a širokého spektra in vitro modelů střevního epitelu (buněčné linie HT-29, Caco-2, kokultura Caco-2 a mononukleárních leukocytů), keratinocytů (buněčná linie HaCaT) a imunitních buněk (buněčná linie RAW 264.7, mononukleární leukocyty). Rovněž jsme za využití světelné mikroskopie, qPCR a NGS popsali mikrobiální složení biomas. Endotoxinová aktivita stanovená PyroGeneTM se mezi jednotlivými vzorky LPS výrazně lišila a často neodpovídala biologické aktivitě pozorované v buněčných modelech. Prozánětlivá aktivita LPS z jednotlivých vodních květů a mechanismus odpovědi se v jednotlivých buněčných modelech lišil; v imunitních buňkách vykazovalo biologickou aktivitu 90 % vzorků, zatímco jen 20 % a méně bylo aktivních v modelech epiteliálních buněk. Při srovnání LPS izolovaných z květu dominovaného určitým sinicovým druhem a LPS z laboratorní sinicové kultury odpovídajícího rodu, vyvolávaly LPS ze sinicových květů obecně silnější pro-zánětlivou odpověď než LPS ze sinicových kultur. Sinicové LPS z axenických kultur pak nevykazovalo žádný nebo téměř žádný prozánětlivý efekt. Z těchto výsledků vyplývá, že za prozánětlivou aktivitou LPS z vodních květů stojí především G- bakterie. Nicméně pouze z poměrného zastoupení G- bakterií v biomase nemůžeme vyvodit výslednou aktivitu vzorku, ale ve spojení se zastoupením třídy Gammaproteobacteria a určitých rodů zahrnujících patogenní druhy (např. Legionella, Vibrio, Aeromonas, Arcobacter) mohou poukázat na sinicové květy s pravděpodobnou pro-zánětlivou aktivitou.

Abstract:

Cyanobacterial water blooms are a global ecological problem, and their lipopolysaccharides (LPS) are among the bioactive compounds they release. The LPS produced by the bloom are a diverse mixture of LPS derived from cyanobacteria and Gram negative (G-) bacteria associated with the bloom. Humans can be exposed to these LPS during recreational activities in bloom-infested waters. In this case, the epithelia come into direct contact with the LPS. However, little information exists on the response of epithelia to cyanobacterial LPS and LPS produced by cyanobacterial blooms, and no information is available on the response of skin and intestinal epithelia. We isolated LPS from cyanobacterial blooms and from laboratory cultures of cyanobacteria. In total, we studied LPS from 23 blooms and four cultured genera of common bloom-forming cyanobacteria (Aphanizomenon, Planktothrix, Dolichospermum, and Microcystis). We used both, standard and strictly axenic cultivation of cyanobacteria, to avoid the possible influence of bacterial LPS on the resulting activity. The pro-inflammatory potential of LPS was determined using the commercial PyroGeneTM assay and in a wide range of in vitro models of intestinal epithelium (cell lines HT-29, Caco-2, co-culture of Caco-2 and mononuclear leukocytes), keratinocytes (HaCaT cell line) and immune cells (RAW 264.7 cell line, mononuclear leukocytes). We also determined the microbial biomass composition by light microscopy, qPCR and NGS. The endotoxin activity determined by the PyroGeneTM assay differed considerably among the LPS samples and often did not correspond to the biological activity observed in the cell models. The potency of individual bloom LPS effects and response patterns varied in different in vitro models, with 90% active in immune cells but 20% or less in the epithelial models. LPS from blooms generally had higher pro-inflammatory potential than LPS from cultures, comparing LPS isolated from blooms with predominance of certain cyanobacterial species and LPS from laboratory cultures of respective cyanobacteria. Cyanobacterial LPS from axenic cultures exerted no or only a mild pro-inflammatory effect. These results suggest G- bacteria as the source of the pro-inflammatory activity of LPS from cyanobacterial blooms. However, the proportion of G- bacteria alone is not indicative of sample activity, but together with the proportion of Gammaproteobacteria and certain genera containing pathogenic species (e.g., Legionella, Vibrio, Aeromonas, and Arcobacter) may indicate likely pro-inflammatory active blooms.

Keywords

sinice, bakterie, LPS, zánět, enterocyt, keratinocyt, imunitní buňka, endotoxin, cyanobacteria, bacteria, inflammation, enterocyte, keratinocyte, immune cell

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 12. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 25. 1. 2024
• Supervisor: RNDr. Lenka Šindlerová, Ph.D.
• Reader: prof. MVDr. Miroslava Palíková, Ph.D., Assoc. Prof. Eng. Yordan Georgiev, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology