Structure-functional studies of lectins from pathogenic organisms

Mgr. Lenka Malinovská, Ph.D.

Doctoral thesis

Anotácia:

Lektiny jsou proteiny, které specificky vážou sacharidy. Uplatňují se v interakcích mezi mikroorganismy a jejich hostiteli v rámci symbiotických i parazitických vztahů. Mikroorganismy mohou využívat lektiny k adhezi na hostitelské buňky, což výrazně podporuje vznik infekce. Zablokování lektinů může zamezit přichycení patogenů na tkáně hostitele a zarazit tak chorobu již v zárodku. Tento předpoklad je principem tzv. anti-adhezní terapie, která je vhodná k léčbě bakteriálních infekcí, a to především těch, které jsou způsobeny kmeny rezistentními k antibiotikům. Pro úspěšný vývoj látek, které jsou schopny zabránit adhezi, je však nutná detailní znalost lektinů a jejich vazebných vlastností. Cílem této disertační práce byla strukturně-funkční charakterizace lektinů z podmíněných patogenů rodu Burkholderia. Konkrétně se jedná o určení jejich vazebné specifity a afinity, termodynamických parametrů vazbu a rovněž struktury. K dosažení cíle bylo využito široké spektrum metod – metody molekulární biologie, afinitní chromatografie, rezonance povrchového plasmonu, izotermální titrační kalorimetrie, krystalografické metody a fluorescenční mikroskopie. Disertační práce je rozdělena do čtyř hlavních částí. První část zahrnuje obecný úvod do lektinologie, popis biologických funkcí lektinů (především bakteriálních) a představení anti-adhezní terapie. Tato část rovněž vymezuje celkové dlouhodobé cíle disertační práce a tří konkrétních projektů, ze kterých se práce skládá. Další tři části jsou zaměřeny na tyto projekty a výsledky získané při jejich řešení. První projekt se zabýval určením vazebné specifity rozpustného lektinu BC2L-A z Burkholderia cenocepacia, cílem druhého projektu byla charakterizace interakcí mezi lektiny u rodu Burkholderia a heptosami z bakteriálních lipopolysacharidů. Cílem třetího projektu byla příprava nového lektinu BC2L-D-ct a určení jeho vazebných vlastností a terciární struktury. Kromě experimentů a výsledků je součástí práce i stručný popis principu použitých metod. Metodika jednotlivých projektů se částečně překrývá, konkrétní metody jsou tedy diskutovány vždy pouze jednou, a to v kapitole, kde je daná metoda nejrelevantnější. Některé výsledky a poznatky získané v rámci prvních dvou projektů byly publikovány. Výsledné tři odborné publikace jsou součástí disertační práce. Práce sama se tedy spíše soustřeďuje na nezveřejněná data (včetně metodických postupů) a publikovaná data představuje jako část mnohem složitější celkové problematiky. Poznatky získané při řešení třetího projektu ještě nebyly shrnuty v publikaci, uvedené výsledky jsou proto detailnější.

Abstract:

Lectins are specific carbohydrate-binding proteins important in both symbiotic and parasitic interactions between microorganisms and hosts. These proteins can mediate adhesion to host cells and promote development of infections. Therefore, blocking of lectins could prevent the attachment of pathogens to host tissues and stop outbreak of diseases at the very beginning. This assumption is the principle of so-called anti-adhesion therapy, an attractive approach for treatment of bacterial infections, especially antibiotic-resistant ones. However, successful development of potent blocking agents primarily depends on detailed knowledge of lectins and their binding properties. The goal of this thesis was structure-functional description of lectins from opportunistic pathogens from genus Burkholderia. This characterization comprised of determination of binding affinity and specificity, thermodynamics parameters and also the structure. Various methods were utilized, including molecular biology methods, affinity chromatography, surface plasmon resonance, isothermal titration calorimetry, crystallographic methods and fluorescence microscopy. This thesis is divided into four major parts. The first part provides general introduction to lectinology, biological functions of lectins (especially bacterial ones) and anti-adhesion therapy. Finally, this introductory chapter defines the long-term aims of the thesis and describes goals of three particular projects.The next three parts are focused on these projects and obtained results. The first project was aimed at characterization of binding specificity of soluble lectin BC2L-A from Burkholderia cenocepacia. The second project examined interactions between Burkholderia lectins and heptoses from bacterial lipopolysaccharides. The goal of the third project was the production of novel lectin (BC2L-D-ct) and its characterization, involving determination of binding properties and structure. In addition to results, a brief background of applied methods is discussed. As the methodology of projects partially overlaps, each method is described only once within the most relevant project.Some data from first two projects were published; the three resulting publications are enclosed. The thesis therefore focuses on additional unpublished data (including methodology development) and published results are presented as a part of the complex picture. Considering the third project, more detailed data are presented as this work has not been summarized in publication yet.

Keywords

Lectins, saccharides, interactions, cystic fibrosis, opportunistic pathogens, Burkholderia, anti-adhesion drugs

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 9. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 10. 2012
• Vedúci: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.
• Oponent: prof. RNDr. Libor Grubhoffer, CSc., prof. Ing. Jitka Moravcová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry