Možnosti detekce jednotlivých molekul peroxidasy

Bc. Ondřej Dvorský

Bachelor's thesis

Towards single molecular detection of peroxidase

Abstract:

Tato bakalářská práce se zabývá křenovou peroxidázou, což je enzym, který je díky své vysoké produkci rostlinou Armoracia rusticana komerčně vhodný pro značení různých biomolekul v biochemických a imunologických analýzách. Jeho katalytická reakce slouží jako zesilovač signálu u biosenzorů, kde je často imobilizován na povrchu signálního převodníku. Pro určování koncentrace H2O2 jsou využívány různé substráty (např. 4CN a DAB), které v reakci s HRP tvoří nerozpustné produkty. Teoretická část se zabývá bližším seznámením s tímto enzymem a jeho popisem. Dále je zde uvedeno a stručně popsáno několik analytických metod, v nichž je HRP často užíváno jako enzymová značka. Patří mezi ně například SPR, QCM a chronopotenciometrie. Experimentální část porovnává různé možnosti detekce odlišných koncentrací imobilizované HRP na modifikovaných sklíčkách (skupiny NH2, Poly-L-lysinová a GOPS) od několika výrobců. Využívá se zde reakce s 4CN a DAB, z nichž vzniklé sraženiny zachycují fluorescein rozpuštěný v roztocích. Vhodnost jednotlivých substrátů a skupin je navzájem porovnávána. K vyhodnocení je použit fluorescenční skener, několik mikroskopických technik a AFM.

Abstract:

This bachelor thesis deals with horseradish peroxidase, which is an enzyme which, thanks to its high production with Armoracia rusticana, is commercially suitable for labeling different biomolecules in biochemical and immunological analyzes. Its catalytic reaction serves as a signal amplifier for biosensors, where it is often immobilized on the surface of the signal transducer. Different substrates (e.g., 4CN and DAB) are used to determine the H2O2 concentration and form insoluble products in reaction with HRP. The theoretical part deals with a closer acquaintance with this enzyme and its description. Several analytical methods are mentioned and briefly described in which HRP is often used as an enzyme label. These include, for example, SPR, QCM and chronopotentiometry. The experimental part compares different possibilities of detecting different concentrations of immobilized HRP on modified slides (NH2, Poly-L-lysine and GOPS) from several manufacturers. Reactions with 4CN and DAB are used here, from which the resulting precipitates capture fluorescein dissolved in the solutions. The suitability of individual substrates and groups is compared to each other. A fluorescence scanner, several microscopic techniques, and AFM are used to evaluate.

Keywords

AFM, Biosenzor, Fluorescence, HRP, Chronopotenciometrie, Impedanční spektroskopie, QCM, SPR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 1. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 5. 2. 2019
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Reader: Mgr. Veronika Poláchová

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry